Box-Behnken响应面法优化玛卡多糖提取工艺
2021-07-15黄贻杰张海珠
黄贻杰，张海珠
（大理大学药学与化学学院，云南 大理 671000）
玛卡（Lepidium meyeniiWalp.），为十字花科植物，原产于南美洲印第安山脉，药食两用，有“南美人参”之誉［1，2］，具有改善性功能、抗疲劳、增强免疫力、调节内分泌、改善记忆、降血糖、抗病毒、提高生殖细胞质量与活力等作用［3-6］。玛卡多糖是玛卡的主要活性成分，而有关玛卡多糖的研究报道较少［7，8］。
玛卡多糖的提取方法有超声提取和加热回流提取。已有报道加热回流提取不如超声提取效率高，且超声提取操作简单、方便、快速、适合工业化生产［9］。本研究采用响应面设计分析，确定玛卡多糖的最佳提取工艺，以期为玛卡多糖的开发利用和质量标准提供依据。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
玛卡样品于2020年采收期采自云南省某种植基地；葡萄糖对照品（天津市福晨化学试剂厂批号20180411）；硫酸、苯酚、乙醇等试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。
2500C型多功能粉碎机（永康市金穗机械制造厂）、SB-25-12DT型超声仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）、HH-S2S型数显恒温水浴锅（上海晖创化学仪器有限公司）、AX224ZH/E型电子天平（奥豪斯仪器有限公司）、UV-9000S型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理 样品打粉，过40目筛，取300.00 g玛咖粉末于圆底烧瓶，加入适量的75%乙醇溶液，加热回流2 h，弃提取液，除去脂溶性成分，残渣挥干溶剂后备用。
1.2.2 提取 精密称取样品粉末2.00 g于三角烧瓶中，加入一定量的去离子水，进行超声提取并抽滤，滤液定容待用。
1.2.3 标准曲线绘制 参考文献［10］，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。同时方程为：A=28.94C+0.07，相关系数r=0.993，在0.004 7～0.026 8 mg/mL线性良好。
1.2.4 玛卡多糖含量测定 取适量提取液，以苯酚-硫酸法测定吸光度代入标准曲线方程中，得其多糖的质量浓度。
1.2.5 单因素试验 称取玛咖粉末2.00 g，考察超声时间（20、30、40、50、60 min）、液料比（20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1）、温度（30、40、50、60、70℃）对玛咖多糖提取率的影响。
1.2.6 响应面设计 考察超声时间、液料比、温度3个因素作为响应因变量，利用Design-expert 8.0.6软件，按照Box-Behnken中心组合试验设计原理，以玛咖提取液中多糖得率为响应值，通过响应面曲面分析进行试验条件的优化，响应面设计因素与水平如表1所示。
表1 响应面设计因素与水平
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 超声时间对多糖得率的影响 当液料比为40∶1、温度为60℃，超声时间在20～30 min内，多糖得率呈上升趋势，然后随时间的延长有所下降（图1）。因此，选择30 min为较佳超声时间。
图1 超声时间对多糖提取的影响
2.1.2 料液比对多糖得率的影响 当超声时间为30 min、温度为60℃，液料比在20∶1～40∶1时，多糖得率逐渐升高，而后多糖得率有所下降（图2）。因此，选择40∶1为较佳提取液料比。
图2 液料比对多糖提取的影响
2.1.3 温度对多糖得率的影响 当超声时间为30min、液料比为40∶1，温度在30～60℃时，多糖得率逐升高，而后随温度的继续升高，多糖提取率下降（图3）。因此，60℃为较佳提取温度。
图3 温度对多糖提取的影响
2.2 响应面设计结果
Box-Behnken响应面试验结果见表2，方差分析见表3。经过Design-expert 8.0.6软件多元回归拟合，得到玛卡多糖的预测模型方程：Y=39.32+2.63A+2.78B+10.21C-0.26AB+1.23AC-0.54BC-2.48A2-4.30B2+1.23C2，其中，Y为玛卡多糖含量，A为超声时间，B为液料比，C为温度。
表2 Box-Behnken效应面试验因素水平及结果
从表3可以看出，温度的“Prob＞F”值小于0.01，表明其对玛卡多糖得率的影响极显著，液料比和超声时间的“Prob＞F”值小于0.05，表明其影响显著，整体模型的“Prob＞F”值小于0.01，表明该二次方程模型高度显著。
表3 回归方程方差分析回归方程方差分析
失拟项F为2.51，P为0.192（P＞0.05），表明方程模型误差较小；决定系数为0.956 5，表明其因变量与全体自变量之间的多元回归关系显著，回归方程对试验拟合情况较好，可用该回归方程对不同提取条件下玛卡多糖得率进行预测。
响应面图形是响应值对各因素（A、B、C）所构成的三维空间曲面图，从图4至图6可看出，各因素交互作用对响应值的影响，温度的影响最为显著，表现为曲线较陡，温度的最佳值在60℃；而超声时间和液料比次之，表现为曲线较为平滑，其最佳响应值分别为40 min和40∶1。
图4 提取时间和液料比对多糖得率的响应面和等高线
图5 提取时间和温度对多糖得率的响应面和等高线
图6 液料比和温度对多糖得率的响应面和等高线
3 小结
本试验以超声时间、液料比、温度为考察因素，采用Box-Behnken响应面法，建立了玛卡多糖提取的二次多项式数学模型，经显著性检验分析，可利用该模型预测玛卡多糖的得率。利用优化后的最佳工艺为超声时间40 min、液料比40∶1、温度60℃，在此工艺下多糖得率为51.21%，该法为玛卡多糖的进一步开发利用和工业化生产奠定了基础。
