龙眼核多酚对LPS 诱导的ALI 小鼠肺组织的保护作用及机制

范风颖，骆 姗，赵 莉

急性肺损伤（ALI）是临床常见的肺部疾病，以持续或急性肺部炎症为病理基础，因嗜中性粒细胞聚集，损伤肺泡-毛细血管屏障，导致出现肺间质水肿、非心源性肺水肿等病理特征[1]。该病发生机制主要是因体内炎性水平升高、氧化应激反应增强导致，氧化应激会增加体内活性氧簇分泌量，引起气道与血管重塑，并侵犯至肺间质，导致肺水肿发生[2]。在实验动物模型建立时，常采用脂多糖（LPS）诱导，LPS是革兰阴性菌主要细胞壁成分，是人体感染革兰阴性菌的重要病原菌，其诱导作用是诱导机体炎症反应过度激活，促进大量活性氧大量释放，引起氧化与抗氧化系统失衡，故会导致肺损伤[3]。目前肺损伤缺乏特异性治疗药物，研究相关治疗药物是重症科研究重点。龙眼也称为桂圆，肉质清脆、味美香甜，果肉内含有丰富的碳水化合物、氨基酸、维生素C、蛋白质等营养物质，并含有丰富的多酚、多糖、多肽、皂苷类活性成分，有双重的营养与药用成分。中医认为龙眼归心、脾经，有补气养血、安神定志、养心健脾功效。有研究[4]表明，除了龙眼肉，龙眼核有双重的营养、保健功效，核内含有的脂肪、生物碱等成分，经多种分离纯化技术并能从龙眼核内提取到多酚成分，起到抗氧化、抗炎、降血糖等作用。但龙眼核多酚是否能够作为治疗ALI 的相关药物，以及其肺组织保护机制缺乏研究报道。现本研究就分析眼核多酚对ALI 小鼠的作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性小鼠40 只（新疆医科大学动物实验中心提供），SPF 级，周龄6～8 w，体重18～22 g；饲养环境SPF 级，室温20～25 ℃，湿度40%～60%，自由摄食、饮水。

1.2 药物与试剂 龙眼核：高州产地；地塞米松片：广东华南药业，国药准字H44024469，0.75 mg/片；脂多糖：Sigma 公司；酶联免疫法试剂盒购自罗氏公司；MR-96A 酶标分析仪购自深圳迈瑞生物；1658001 蛋白印迹电泳仪购自美国BioRad 公司；TD5-Ⅱ型离心机购自长沙平凡；SW-CJ-1FD 型超净工作台购自苏州安泰。

1.3 龙眼核多酚提取 将龙眼核研磨成粉，精密称量后，过60 目筛，备用。粉末200 g，加入95%乙醇1 L，70 ℃环境下，对龙眼核粉末进行搅拌，提取3 次，每次作用3 h。合并提取液，离心15 min，3500 r/min，压缩提取液至无醇味浸膏。添加蒸馏水后分散，石油醚脱脂，对其分别加入氯仿、乙酸乙酯等溶剂萃取，合并萃取液，再压缩、回收，对不同浓缩物进行干燥，液-液萃取法分离出龙眼核多酚。

1.4 动物模型建立 动物模型建立：小鼠得到1 w适应性喂养，模型建立前连续灌胃3 d，对照组、模型组分别腹腔注射等量生理盐水，地塞米松组：腹腔注射地塞米松20 mg/kg；龙眼核多酚组：腹腔注射龙眼核多酚20 mg/kg，连续3 d，末次给药1 h 后于小鼠尾部静脉注射LPS 0.5 ml，建立ALI 模型，其中对照组仅注射等量生理盐水。

造模完成24 h 后，摘除小鼠眼球，留取血液标本，对血液标本离心15 min，3500 r/min，将血液标本置于-20 ℃环境内保存。将小鼠处死后，开胸取左肺组织，吸干血迹后，电子秤测量肺组织湿重，随后将肺组织置入60 ℃烘箱内，连续48 h 后测量干重，计算干湿重比值：湿重/干重。取肺组织，甲醛固定24 h，切片，HE 染色，用显微镜观察肺组织病理特征，对肺泡水肿、肺泡充血、肺间质水肿、肺泡壁增厚，分别计0～4 分：0 分：无改变；1 分：轻微变化；2分：中度变化；3 分：重度改变；4 分：极重度改变。小鼠处死后，分离器官，左肺用磷酸缓冲液冲洗，连续3 次，收集灌洗液，离心10 min，2000 r/min，收集上清液，磷酸缓冲液重悬，涂抹在载玻片，以Giemsa 染色，计算嗜中性粒细胞、白细胞的数量，酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6及IL-1β。留取的分离血液标本用WST-1 法检测血清氧化应激指标：包括超氧化物歧化酶（SOD），测定肺组织内丙二醛（MDA）。分离提取细胞总蛋白后，用增强化学发光法计算高迁移率族蛋白（HMG）B1、核因子（NF）-κB 表达。

1.5 统计学方法 应用SPSS20.0 统计软件分析。计量数据用x±s 表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理特征 对照组小鼠肺组织结构完整，肺泡腔内无渗出物，肺间质正常，肺泡间隔无增厚；模型组肺泡结构被破坏，肺泡腔炎性浸润，肺间质水肿，肺泡间隔增厚明显，病理平均分为（12.51±3.48）分；地塞米松、龙眼核多酚组肺泡腔炎性减轻，肺间质水肿缓解，肺泡间隔增厚不明显，平均病理分分别为（4.81±1.63）、（5.02±0.65）分，地塞米松、龙眼核多酚组高于模型组（t=5.667，5.984；P=0.001,0.001）；而两组比较无显著差异（P>0.05）。

2.2 湿重/干重比值 对照组肺组织湿重/干重比值明显低于其他3 组（P<0.05），而地塞米松、龙眼核多酚组较模型组下降（P<0.05），但地塞米松、龙眼核多酚组比较无显著差异（P>0.05），见表1。

表1 4 组肺组织湿重/干重比值

注：与对照组比较,①P <0.05;与模型组比较,②P <0.05

2.3 炎性水平 对照组嗜中性粒细胞、白细胞计数、TNF-α、IL-6 及IL-1β 均低于其他3 组（P<0.05），而地塞米松、龙眼核多酚组较模型组下降（P<0.05），但地塞米松、龙眼核多酚组比较无显著差异（P>0.05），见表2。

表2 4 组炎性水平比较

2.4 氧化应激反应 对照组SOD 表达高于其他3 组，MDA 表达低于其他3 组（P<0.05），而地塞米松、龙眼核多酚组SOD 表达高于模型组，MDA 表达低于模型组（P<0.05），但地塞米松、龙眼核多酚组比较无显著差异（P>0.05），见表3。

表3 四组氧化应激反应比较

2.5 HMGB1、NF-κB 表 达 模 型 组HMGB1、NFκB 表达较对照组升高（P<0.05），而地塞米松、龙眼核多酚组表达有所下降，较模型组低（P<0.05），见表4。

表4 不同H MGB1、N-?B 表达比较

表4 不同H MGB1、N-?B 表达比较

注：与对照组比较，①P <0.05;与模型组比较，②P <0.05

3 讨论

ALI 发病机制复杂、进展迅猛，其中革兰阴性菌感染是其主要致病因素，诱发肺部炎性细胞浸润及氧化应激反应，导致肺间质水肿、肺泡腔渗出[5-6]。脂多糖存在革兰阴性菌细胞壁外膜，在注射脂多糖后会建立ALI 模型，为动物实验展开奠定基础[7-8]。本组研究，在用脂多糖诱导肺组织损伤小鼠模型，经初死解剖肺泡结构被破坏，肺泡腔炎性浸润，肺间质水肿，肺泡间隔增厚明显。故采用脂多糖诱导，能成功建立ALI 小鼠模型。本组研究，3 组小鼠的肺组织病理评分、肺组织湿重/干重比值均高于对照组，其中模型组增加明显，地塞米松、龙眼核多酚有所下降（P<0.05）。结果证实采用地塞米松与龙眼核多酚能减轻小鼠肺组织病理损伤，缓解肺泡间质水肿，故肯定龙眼核多酚对肺组织有一定的保护作用。

ALI 是因炎症细胞浸润所致，外界环境改变，或促进嗜中性粒细胞活性，白细胞计数升高，产生过度炎症反应，损伤肺组织上皮细胞[9-10]。本组研究，ALI 小鼠建立成功后，嗜中性粒细胞、白细胞计数、TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平均明显升高，且高于对照组，但在采用地塞米松、龙眼核多酚后其表达均明显下降（P<0.05）。结果表明龙眼核多酚能够下降小鼠炎症反应。龙眼核含有的生物碱、多酚等成分，具备理化除湿、止血镇痛作用，且在现代药理[11]研究中，通过提取龙眼核相关物质，对多种病原菌起到不同程度的抑制作用，而多酚成分占龙眼核主要部分，故能肯定该物质的作用。氧自由基增强过度是致ALI 的重要原因，而且炎症细胞通过浸润肺组织，会促进氧化应激反应[12-13]。SOD 是内源性抗氧化系统的重要因子，MDA 是体内自由基脂质过氧化反应后形成的产物，两者表达直接反映了肺组织损伤程度[14]。本组研究对照组SOD 表达高于其他3 组，MDA 表达低于其他3 组（P<0.05），而地塞米松、龙眼核多酚组SOD 表达高于模型组，MDA 表达低于模型组（P<0.05），但地塞米松、龙眼核多酚组比较（P>0.05）。结果证实在建立动物模型后，氧化应激反应明显，而在用药后可改善模型氧化损伤，以此能缓解肺组织炎性浸润，降低炎症水平。孙菡峥等[15]报道指出于龙眼核内提取多酚含量为53.68 mg/g，抗氧化性能高，对氧自由基的清除率(73.90±0.60)%。杨敦杰等[16]报道龙眼核内含有丰富的多酚类物质，50%乙醇萃取物之总多酚化合物含量最高，且清除超氧阴离子能力最高。本组研究，地塞米松、龙眼核多酚组HMGB1、NF-κB 表 达 均 低 于 模 型 组（P<0.05）。HMGB1 是反映肺损伤的重要因子，其表达可激活Toll 样受体4/NF-κB 通路，导致肺损伤的发生[17-18]。研究提示龙眼核多酚通过下降HMGB1、NF-κB 表达，而起到保护肺组织的作用。

基于此，本研究认为龙眼核多酚通过抑制小鼠氧化应激反应，降低肺组织炎症反应，起到肺组织保护作用，缓解肺损伤程度。虽然其作用与地塞米松的作用效果无明显差异，但在长期临床实践中发现，地塞米松不良反应多，会诱发呼吸困难、过敏性休克、低钾血症等严重并发症，此时为龙眼核多酚的临床应用奠定基础[19-20]。

综上所述，龙眼核多酚通过减轻因LPS 诱导的ALI 小鼠的炎症反应，抑制氧化应激反应，起到肺组织保护作用，缓解肺损伤程度。