PTEN表达对恶性脑胶质瘤细胞放射敏感性的影响及其机制研究

李欣欣，杨永辉，李京，任秉辉，王辉，朱雁冰

恶性脑胶质瘤是临床上常见的颅脑肿瘤，其占颅脑肿瘤的比例高达60%[1]，主要以浸润性方式生长，与脑组织无明确分界，通过手术难以彻底切除；并且扩散速度快，复发性高。目前，手术切除后联合放疗是恶性脑胶质瘤极为重要的治疗方法，但大部分脑胶质瘤对放疗不敏感，导致治疗效果仍不理想[2]。因此，增强恶性脑胶质瘤的放射敏感性成为了优化治疗，改善患者预后的一个重要途径。近年来研究发现，第10号染色体缺失性磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一种具有磷酸酶活性的肿瘤抑制因子，在各种肿瘤的发生发展中发挥作用[3]。目前研究发现，PTEN在肺癌、晚期乳腺癌、晚期结直肠癌中均异常表达[4-5]。另外有研究显示，PTEN失活及survivin高表达是胃癌发展及预后的关键因素[6]；中华龙胆总黄酮通过PI3K/AKT/PTEN信号通路诱导肝癌细胞凋亡[7]。然而，PTEN对恶性脑胶质瘤放射敏感性的影响目前尚不清楚。为此，本研究采用细胞实验方法探讨PTEN对恶性脑胶质瘤放射敏感性的影响及其机制，以进一步阐明PTEN在恶性脑胶质瘤T98G细胞中的关键作用。

1 材料与方法

1.1 材料 恶性脑胶质瘤组织(20例)以及距病变部位≥2 cm的癌旁正常组织标本(10例)来自开滦总医院；采集的标本经过患者和家属同意，保存在液氮中备用。恶性脑胶质瘤U251细胞和T98G细胞，正常脑胶质HEB细胞(上海中国科学院细胞库)；DMEM(Dulbecco’s-modified Eagle’s medium)培养基，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美国Sigma公司)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和LipofectamineTM2000(大连Takara公司)；PI3K抑制剂LY294002、AKT抑制剂CCT128930(美国Selleck生物科技公司)；PI3-kinase p110γ抗体，GAPDH多克隆抗体(上海圣克鲁斯生物公司)；Anti-pan-AKT，Anti-GSK3β抗体(英国abcam公司)；siRNA NC，PTEN siRNA，pcDNA-PTEN质粒(北京擎科生物有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在含10% FBS的DMEM培养基中培养U251细胞、T98G细胞和HEB细胞，于37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。当细胞汇合度约为90%时，用0.25%的胰蛋白酶进行传代培养。取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞转染 取处于对数生长期的细胞铺于12孔板中，细胞汇合至75%～80%时，将培养基更换成无血清培养基；用无FBS培养基稀释各组重组质粒和LipofectamineTM2000，将稀释后的重组质粒和脂质体混匀，室温孵育20 min；将混合物滴加到细胞中，或转染重组质粒后，采用0、2、4、6 Gy的X线垂直照射细胞，所用剂量率为3 Gy/min；48 h后收集各组细胞RNA和蛋白进行生物学功能实验。

1.2.3 细胞增殖测定 取处于对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化细胞制成细胞悬液，接种于96孔板中；细胞汇合达70%～80%时，使用LipofectamineTM2000转染质粒，或转染后用6 Gy X线照射细胞，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h后弃上清，每孔加入10 μL浓度为5 mg/mL的四甲基偶氮唑盐(tetramethylazozolium salt，MTT)溶液；孵育4 h后去上清，加入150 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)终止反应，用酶标仪读取490 nm处每孔细胞的吸光度值。

1.2.4 细胞侵袭实验 将-20 ℃保存的matrigel置于4 ℃融化，用无FBS DMEM培养基稀释matrigel浓度为1 mg/mL。每个上室中加入100 μL稀释后的matrigel，室温孵育干成胶状。细胞汇合达95%时，用6 Gy X线照射细胞，0.25%的胰酶消化后，用无FBS的DMEM培养基稀释为细胞悬液，加入Transwell小室中；下室中加入完全培养基，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色20 min，在显微镜下选取5个视野细胞观察并计数。

1.2.5 细胞凋亡率检测 用LipofectamineTM2000转染试剂将各组重组质粒转染至T98G细胞，用6 Gy X线照射细胞，0.25%胰酶消化后，用完全培养基进行中和，1 000 r/min离心15 min，弃上清。将沉淀置于70%的乙醇中，4 ℃固定过夜，采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡水平。

1.2.6 PTEN mRNA表达量检测 采用实时荧光定量PCR方法。将恶性脑胶质瘤组织和癌旁组织从液氮中取出，加入液氮进行研磨，破碎后按RNA提取试剂盒说明书的步骤提取各组织中总RNA。取各对数生长期的恶性脑胶质瘤细胞，使用Trizol提取细胞RNA。用Nanodrop检测总RNA的浓度和纯度，使用Takara反转录试剂盒反转成cDNA，逆转录得到的cDNA为模板，进行RT-qPCR；反应程序为95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；用2-△△Ct法分析实验结果。实验所用的引物为：GAPDH-F：CAAGGACCTCTACGCCAACAC；GAPDH-R：TGGAGGCGCGATGATCTT；PTEN-F：CACAGA-ATTCCAGACATGACAGCCATCATC；PTEN-R：GTG-GATCCTCATGGTGTTTTATCCCTCTTG。

1.2.7 PTEN蛋白表达水平检测 采用Western blot法。从液氮中取出肿瘤组织和癌旁组织剪碎，加入RIPA裂解液后研磨成组织匀浆，从组织蛋白中提取总蛋白。T98G细胞根据提取蛋白说明书提取总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度，取适量样品进行点样，以5%的浓缩胶、12%的分离胶进行电泳，结束后采用湿转将蛋白湿转到PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉配制封闭液，将膜置于封闭液中在摇床上室温封闭120 min。加入一抗在4 ℃下过夜反应，TBST清洗5次，每次5 min，再与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，采用ECL法进行蛋白显影。

2 结 果

2.1 恶性脑胶质瘤组织和细胞的PTEN表达量 恶性脑胶质瘤组织的PTEN mRNA和蛋白表达量明显低于瘤旁正常组织(均P<0.01)(图1A-C)。脑胶质瘤U251细胞和T98G细胞的PTEN mRNA和蛋白表达量明显低于正常脑胶质HEB细胞(P<0.05～0.01)，且在恶性脑胶质瘤T98G细胞中的表达量最低(P<0.01)(图1D-F)。因此选择恶性脑胶质瘤T98G细胞用于后续实验。

A：恶性脑胶质瘤与癌旁正常组织的PTEN mRNA表达量比较；B：恶性脑胶质瘤与癌旁正常组织的PTEN蛋白表达水平检测；C：恶性脑胶质瘤与癌旁正常组织的PTEN蛋白表达水平比较；D：HEB、U251和T98G细胞的PTEN mRNA表达量比较；E：HEB、U251和T98G细胞的PTEN蛋白表达水平检测；F：HEB、U251和T98G细胞的PTEN蛋白表达水平比较(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.2 不同剂量X线照射T98G细胞的PTEN表达量比较 2 Gy、4 Gy、6 Gy X线照射T98G细胞的PTEN mRNA和蛋白表达量明显高于无X线照射(0 Gy)T98G细胞(P<0.05～0.001)；并且随X线照射剂量增高，T98G细胞的PTEN表达量亦升高。见图2。

A：不同剂量X线照射T98G细胞的PTEN mRNA表达量比较；B：不同剂量X线照射T98G细胞PTEN蛋白表达水平检测；C：不同剂量X线照射T98G细胞的PTEN蛋白表达水平比较(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.3 过表达PTEN对T98G细胞放射敏感性的影响 与pcDNA-3.1(+)组相比，pcDNA-PTEN组和pcDNA-3.1(+)+6 Gy组细胞的PTEN mRNA表达量均明显升高(P<0.001，P<0.01)；与pcDNA-3.1(+)+6 Gy组相比，pcDNA-PTEN+6 Gy组细胞的PTEN mRNA表达量明显升高(P<0.001)(图3A)。与pcDNA-3.1(+)组相比，pcDNA-PTEN组和pcDNA-3.1(+)+6 Gy组T98G细胞活力明显下降、细胞侵袭数明显减少、细胞凋亡率明显增高(P<0.05～0.01)；与pcDNA-3.1(+)+6 Gy组相比，pcDNA-PTEN+6 Gy组T98G细胞活力下降、细胞侵袭数明显减少、细胞凋亡率明显增高(P<0.05～0.01)(图3B-F)。

A：各组细胞的PTEN mRNA表达量比较；B：各组细胞的生长活性比较；C：各组细胞侵袭实验的结果(结晶紫染色，×200)；D：各组细胞侵袭数比较；E：流式细胞仪检测各组细胞凋亡数；F：各组细胞的凋亡率比较(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.4 下调PTEN对T98G细胞放射敏感性的影响 PTEN siRNA组T98G细胞的PTEN mRNA表达量显著低于siRNA NC组，siRNA+6 Gy组细胞的PTEN mRNA表达量明显高于siRNA NC组和PTEN siRNA+6 Gy组(均P<0.01)(图4A)。与siRNA NC组相比，PTEN siRNA组T98G细胞活力明显升高、细胞侵袭数明显增加、细胞凋亡率明显降低(P<0.05～0.01)，siRNA+6 Gy组T98G细胞活力明显降低、细胞侵袭数明显减少、细胞凋亡率明显升高(P<0.05～0.01)；与siRNA+6 Gy组相比，PTEN siRNA+6 Gy组T98G细胞活力升高、细胞侵袭数明显增加、细胞凋亡率明显降低(P<0.05～0.01)(图4B-F)。

A：各组细胞的PTEN mRNA表达量比较；B：各组细胞的生长活性比较；C：各组细胞侵袭实验结果(结晶紫染色，×200)；D：各组细胞的侵袭数比较；E：流式细胞仪检测各组细胞凋亡数；F：各组细胞的凋亡率比较(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.5 敲低PTEN对T98G细胞PI3K-AKT-GSK3β信号通路的影响 PTEN siRNA组细胞的PTEN mRNA表达量明显低于siRNA NC组(P<0.01)(图5A)。与siRNA NC组相比，PTEN siRNA组细胞PI3K、AKT和GSK3β蛋白的磷酸化水平以及p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、p-GSK3β/GSK3β比值均显著升高(P<0.05～0.01)(图5B-C)。用PI3K抑制剂LY294002预处理细胞后，阻断了敲低PTEN诱导的AKT磷酸化；用AKT抑制剂CCT128930预处理细胞后，阻断了敲低PTEN诱导的GSK3β磷酸化(图5D-G)；表明AKT作用于PI3K的下游，而GSK3β作用于AKT的下游。

A：PTEN siRNA组与siRNA NC组细胞PTEN mRNA表达量比较；B：两组细胞的PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白表达量；C：两组细胞的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β表达水平比较；D：LY294002处理组及PTEN siRNA组、siRNA NC组细胞的AKT、p-AKT蛋白表达量；E：3组细胞的p-AKT/AKT表达水平比较；F：CCT128930处理组及PTEN siRNA组、siRNA NC组细胞的GSK3β、p-GSK3β蛋白表达量；G：3组细胞的p-GSK3β/GSK3β表达水平比较(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

2.6 敲低PTEN激活PI3K-AKT-GSK3β信号通路对T98G细胞放射敏感性的影响 与siRNA NC组相比，PTEN siRNA组细胞的PTEN mRNA表达量明显下降，siRNA NC+6 Gy组细胞的PTEN mRNA表达量明显升高(均P<0.01)；与siRNA NC+6 Gy组相比，PTEN siRNA+6 Gy组细胞的PTEN mRNA表达量明显下降(P<0.01)(图6A)。与siRNA NC组相比，PTEN siRNA组细胞活力明显上升、细胞侵袭数明显增多、细胞凋亡率降低(P<0.05～0.01)，siRNA NC+6 Gy组细胞活力下降、细胞侵袭数减少、细胞凋亡率增高(P<0.05～0.01)；与siRNA NC+6 Gy组相比，PTEN siRNA+6 Gy组细胞活力上升、细胞侵袭数增多、细胞凋亡率降低(P<0.05～0.01)；与PTEN siRNA+6 Gy组相比，PTEN siRNA+6 Gy+LY294002组细胞活力降低、细胞侵袭数减少、细胞凋亡率增高(均P<0.05)(图6B-F)。结果表明敲低PTEN激活PI3K-AKT-GSK3β信号通路影响T98G细胞的放射敏感性。

A：各组细胞PTEN mRNA表达量比较；B：各组细胞的生长活性比较；C：各组细胞侵袭实验结果(结晶紫染色，×200)；D：各组细胞侵袭数比较；E：流式细胞仪检测各组细胞的凋亡数；F：各组细胞的凋亡率比较(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)

3 讨 论

近年来恶性脑胶质瘤的发病率不断上升，患者的预后不良，严重影响着生命健康。因此深入探讨恶性脑胶质瘤的致病机制具有重要意义。PTEN是具有蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，并通过其双特异性磷酸酶活性调控多种信号途径，进而调控各种细胞的生命进程。研究发现，PTEN在肿瘤的形成中起重要作用，在多种肿瘤组织中表达异常，另外在肿瘤组织中常出现缺失或突变。如有研究显示，在食管癌患者中PTEN表达下调[8]，在原位癌和外阴鳞状细胞癌中PTEN发生了突变[9]，在肾癌、乳腺癌、脑癌和胰腺导管腺癌等癌症中出现缺失或突变[10-12]。本研究分析了恶性脑胶质瘤的PTEN mRNA和蛋白表达水平，实验结果显示，恶性脑胶质瘤组织和T98G细胞的PTEN mRNA和蛋白表达显著下调，表明PTEN的异常表达与恶性脑胶质瘤的发生具有相关性。

由于晚期恶性脑胶质瘤患者对放射治疗不敏感，对患者预后产生严重影响；因此，提高恶性脑胶质瘤对放射治疗的敏感性至关重要。研究表明，细胞内基因调控的DNA损伤修复、细胞凋亡和细胞增殖等过程与放射敏感性密切相关；基因多态性及基因变异等都与放射敏感性相关[13-14]。PTEN负调控细胞周期和多种信号途径，能够抑制细胞的迁移、分化、衰老及凋亡等多种生理活动。研究发现，抑癌基因PTEN诱导膀胱癌细胞的凋亡与其脂质磷酸酶抑制AKT的磷酸化有关[15]；在结直肠癌中，TRIM14通过抑制PTEN促进细胞增殖及抑制细胞凋亡[16]。最近研究发现，敲除PTEN在乳腺、皮肤及前列腺等多组织器官中的表达会引起肿瘤形成[17]。此外，miR-548-3p通过核因子活化B细胞的Κ轻链增强子(nuclear factor-Κ-gene binding，NF-kB)靶向PTEN增加非小细胞肺癌的侵袭性[18]。本研究结果显示，恶性脑胶质瘤细胞经X线照射后，PTEN mRNA和蛋白表达量显著升高，呈现出照射剂量依赖性。因PTEN是肿瘤抑制基因，在癌细胞内的表达量较低；而恶性脑胶质瘤细胞经X线照射后细胞活力明显降低，肿瘤细胞受到刺激后可能促使PTEN表达量明显升高，进一步发挥肿瘤抑制作用。过表达PTEN的T98G细胞经X线照射后，其活力明显下降、细胞侵袭数减少及细胞凋亡率增高；而用siRNA技术下调PTEN表达的T98G细胞行X线照射后，细胞活力明显上升、细胞侵袭数增多及细胞凋亡率减低。结果表明，过表达PTEN能够增强T98G细胞的放射敏感性，而下调PTEN能够降低细胞的放射敏感性。

Alzahrani研究证实，PTEN失活能够激活PI3K-AKT信号通路；而活化的PI3K-AKT信号通路参与了细胞增殖、细胞凋亡、调控内皮生长和血管生成等生物学进程[19]。如Yoon等研究发现，红皮莲干果中的甲基lucidone通过抑制PI3K/AKT通路，引起卵巢癌细胞G2/M期阻滞和凋亡[20]。还有研究报道，非瑟酮通过调控PI3K/AKT/mTOR通路发挥对乳腺癌细胞的抗癌作用[21]。本研究显示，敲低恶性脑胶质瘤细胞的PTEN表达并行X线照射后，激活了细胞的PI3K-AKT-GSK3β信号通路，而且该信号通路介导了敲低PTEN对恶性脑胶质瘤放射敏感性的影响。结果表明，沉默PTEN能够通过激活PI3K-AKT-GSK3β信号通路影响恶性脑胶质瘤细胞的放射敏感性。有研究报道，肿瘤组织和细胞内含有高水平的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，有利于维持肿瘤细胞的恶性表型；而敲低PTEN表达后，降低了ROS对AKT通路的阻断，而使PKB/AKT通路保持一个高活化状态，抵抗ROS诱导的细胞凋亡，进一步使肿瘤细胞的放射敏感性降低[22]。本研究的结果与其一致，表明在恶性脑胶质瘤细胞中，PTEN也是通过PI3K-AKT-GSK3β通路影响肿瘤细胞的放射敏感性；推测其作用机制也可能与细胞的ROS水平有关，但具体机制还需要进一步深入研究。

综上所述，PTEN在恶性脑胶质瘤中起抑癌作用，沉默PTEN能够通过激活PI3K-AKT-GSK3β信号通路影响恶性脑胶质瘤细胞的放射敏感性。本研究结果表明，PTEN/PI3K-AKT-GSK3β轴可能成为增强恶性脑胶质瘤患者放射敏感性的重要靶点。