CRISPR技术对发酵乳制品中嗜酸乳杆菌的检测应用

孟冬青　李林显　王金　刘婷婷　于靓　俞漪　刘洋　赵磊　郭敦爱　蒋祯珍　赵渝

摘  要： 借助CRISPR-HOLMES系统，以市售酸奶作为检测对象，检测了其中的嗜酸乳菌含量.结果表明：CRISPR技术可作为一种有效直观的方法实现对发酵乳制品中嗜酸乳杆菌的定性检测.

关键词： 乳制品; 嗜酸乳杆菌; CRISPR; 实时荧光定量PCR

中图分类号： Q 93.331    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2021）02-0142-04

Application of CRISPR technology in the detection ofLactobacillus acidophilusin fermented dairy products

MENG Dongqing， LI Linxian， WANG Jin， LIU Tingting， YU Jing， YU Yi，LIU Yang， ZHAO Lei， GUO Dunai， JIANG Zhenzhen， ZHAO Yu^*

（College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China）

Abstract： In this paper，we detectedLactobacillus acidophiluscontent of some commercial brand yoghurts by using CRISPR-HOLMES system.The results showed that the CRISPR technology can be used as an effective and visual method to qualitatively detectLactobacillus acidophilusin fermented dairy products.

Key words： dairy product; Lactobacillus acidophilus; CRISPR; quantitative real-time PCR

0  引言

CRISPR是众多细菌和古细菌在进化过程中产生的适应性免疫系统，该系统由簇状的短回文重复序列构成^[1].细菌和古细菌在发挥其免疫系统时会经历适应阶段、表达阶段和干扰阶段，在受到病毒或噬菌体侵染时，首先将侵染者的基因组片段整合到自身的基因组中，随后在体内进行复制转录，形成crRNAs（CRISPR RNAs），最终形成记忆片段;当再次受到侵染时，针对不同类型的核酸片段，crRNAs将引导对应的Cas蛋白发挥核酸酶的功能，进而识别入侵者的核酸片段，并进行切割^[2].因此，在CRISPR系统开发的初期，研究者将其大量应用于生物体的基因编辑和敲除，随后，基于Cas12a蛋白和Cas12b蛋白的反式切割活性.王金课题组^[3-4]开发了名为HOLOMOS的核酸检测系统，当体系中存在Cas蛋白、sgRNA（small guide RNA）以及待检测的靶核苷酸片段时，sgRNA先与Cas蛋白结合形成二元复合物，当与sgRNA互补的靶标存在时，两者经碱基互补配对相结合，形成Cas蛋白、sgRNA和靶标核酸的三元复合物，由此激活Cas蛋白的反式切割活性.在该检测体系中，加入single-stranded DNA （ssDNA）荧光探针，完整的ssDNA上存在探针荧光基团和淬灭基团，因此不会发出荧光;当被Cas蛋白切割后，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光信号，被荧光定量PCR（qPCR）收集，进而达到定性检测的目的.

嗜酸乳杆菌是发酵乳制品中常用的乳酸菌菌种，作为肠道益生菌在维持肠道菌群平衡以及拮抗致病菌方面具有良好的作用^[5].随着乳酸菌产业的不断发展，当今市面上的发酵乳制品种类越来越多，因此需要一种灵敏高效的手段来检测发酵乳制品中的乳酸菌指标.作为新型的核酸检测技术，CRISPR相对于其他检测手段具有较为明显的灵敏度和特异性.本文采用CRISPR技术的HOLOMOS系统对产品中的嗜酸乳杆菌进行检测，经qPCR收集到的荧光值在2×10⁵～3×10⁵之間，与对照组中的荧光信号值相比，有明显的差异.

1  材料与方法

1.1 材料

实验中所用5种标准菌株如表1所示，菌株均由上海市质量监督检验技术研究院提供.5种市售乳制品自行购买，如表2所示.

1.2 仪器与设备

东胜ETC811 PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司），Tanon EPS200电泳仪（上海天能科技有限公司），Tanon1600全自动数码凝胶图像分析系统（上海甄明科学仪器有限公司），精宏电热恒温水浴锅（上海右一仪器有限公司），Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪（上海昔今实验仪器有限公司）.

1.3 方法

1.3.1 核酸提取

标准菌株在37 ℃下过夜培养，8 000 r?min^-1离心1 min，彻底弃去培养基，然后用DNA快速提取试剂盒进行核酸提取.

待测品核酸提取步骤：按照中华人民共和国国家标准GB 4789.35—2016^[6]进行样品制备，首先吸取25 mL样品，放入装有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶中，涡旋振荡混匀，制成1∶10的样品混合液.取2 mL待测样品以1 000 r?min^-1离心5 min，弃去沉淀，取1 mL上清，12 000 r?min^-1离心5 min，弃去上清，所得沉淀即菌体，用DNA快速提取试剂盒进行核酸提取.

1.3.2 核酸扩增

在NCBI数据库上进行比对分析，设计针对乳酸菌扩增的通用引物序列（Primer?F：5'to3' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;Primer?R：5'to3'CTACGGCTACCTTGTTACGA），扩增片段长度为1 529 bp.选择嗜酸乳杆菌的SPIDR序列设计嗜酸乳杆菌的扩增引物（Spidr?F：5'to3'CGTCGGCTTCATAATTCTTCAG;Spidr?R：5'to3'GGCAACTTGATCGCTTTACTAG），扩增片段长度为279 bp.

PCR扩增条件：1） 嗜酸乳杆菌扩增，95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，退火温度56 ℃，15 s，延伸温度72 ℃，15 s，彻底延伸温度72 ℃，5 min，进行32个循环;2） 乳酸菌扩增，95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，退火温度56 ℃，15 s，延伸温度72 ℃，1 min，彻底延伸72 ℃，5 min，进行32个循环.

1.3.3 sgRNA的合成

CRISPR系统中Cas12b蛋白识别的PAM序列为TTN^[7]，以实验室先前修饰改造构建的PUC18?DNMT1?3质粒为模板DNA，先扩增出转录sgRNA的模板DNA，并进行柱回收.然后在37 ℃下过夜进行体外转录合成sgRNA，转录体系（50 ?L）：10×Transcription Buffer 5 ?L，NTPs（10 mmol?L^-1）10 ?L，T7 RNA Polymerase 4 ?L，RRI 1 ?L，Template DNA 300～500 ng，RNase-free water补足50 ?L.转录结束后，用DNaseⅠ消化模板DNA，再使用RNA回收试剂盒进行回收，最后用Nanodrop软件对回收的RNA定量.

1.3.4 CRISPR反应

CRISPR反应体系（20 ?L）：包括AapCas12b （10 mmol?L^-1） 0.5 ?L，sgRNA （10 mmol?L^-1）1 ?L，ssDNA荧光探针（10 mmol?L^-1） 1 ?L，靶标DNA 1 ?L，10×NEBuffer 3.1 2 ?L，RRI 0.25 ?L，Nuclease-free H₂O补足到 20 ?L.在qPCR仪中进行反应，48 ℃下，每1 min检测一次信号，至荧光信号饱和即可.

2  结果与分析

2.1 靶标扩增结果

以从标准菌株以及实际样品菌株中提取的基因组为模板，进行靶标的扩增，扩增结束后，取4 ?L PCR产物，在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳.电泳结束后，在全自动数码凝胶图像分析系统上查看扩增结果，结果如图1所示.由图1可知：5种标准菌株和5种从实际样品中提取出来的核酸片段均扩增出来大小正确的条带，通过后续的回收，作为CRISPR反应体系中的待测片段

2.2 qPCR检测CRISPR反应结果

取核酸物质的量浓度为5 nmol?L^-1的标准菌株和实际样品进行CRISPR反应，每个待测样3次重复，加入到CRISPR反应体系中，在48 ℃下，间隔1 min测1次信号值，1 h结束反应.

反应结果如图2所示，嗜酸乳杆菌的标准菌株以及含嗜酸乳杆菌的样品随着反应的进行，荧光值不断增高，表明Cas蛋白、sgRNA与互补的靶标结合，形成三元复合物后，激活了Cas蛋白的切割活性，反应体系中的ssDNA荧光探针被切割，经qPCR仪收集到荧光信号.反之，非嗜酸乳杆菌的标准菌株以及不含嗜酸乳杆菌的样品中，荧光信号值无变化，表明反应体系中不存在与sgRNA互补的嗜酸乳杆菌核酸片段.该实验证明：CRISPR技术可对发酵乳制品中的嗜酸乳杆菌进行定性检测.

3  结论

借助CRISPR技术对市售酸奶中添加的乳酸菌菌种进行了检测.在CRISPR反应体系中，加入针对嗜酸乳杆菌设计的引物以及sgRNA，通过qPCR仪收集荧光信号.实验结果证明：CRISPR技术可以实现对发酵乳制品中的微生物检测，作为新型核酸检测技术，相对于传统检测手段，具有更加灵敏、高效、直观的优点，随着方法的不断完善，其有望成为适应现场环境检测的手段.

参考文献：

[1]  BARRANGOU R，DUDLEY E G.CRISPR-based typing and next-generation tracking technologies [J].Annual Review of Food Science and Technology，2016，7：395-411.

[2]  LI L X，LI S Y，WU N，et al.HOLMESv2：a CRISPR-Cas12b-assisted platform for nucleic acid detection and DNA methylation quantitation [J].ACS Synthetic Biology，2019，8（10）：2228-2237.

[3]  LI Y，LI S Y，WANG J，et al.CRISPR/Cas systems towards next-generation biosensing [J].Cell Press Review，2019，37（7）：730-743.

[4]  LI S Y，CHENG Q X，WANG J M，et al.CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection [J].Cell Discovery，2018，4（1）：20.

[5]  周秀琴.嗜酸乳桿菌的保健作用和在发酵乳中的应用 [C]//中国食品工业协会发酵工程研究会第十五次年会文献集.杭州：中国食品工业协会发酵工程研究会，2007：74-77.

ZHOU X Q.Health care effect of lactobacillus acidophilus and its application in fermented milk [C]//Document of the 15th Annual Meeting of Fermentation Engineering Research Association of China Food Industry Association.Hangzhou：Fermentation Engineering Research Association of China National Food Industry Association，2007：74-77.

[6]  中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验：GB 4789.35—2016 [S].北京：中国标准出版社，2016.

The Minister of Health of the Peoples Republic of China.National Standards for Food Safety：Microbiological Examination of Food-Lactic Acid Bacteria Test：GB 4789.35—2016 [S].Beijing：Standards Press of China，2016.

[7]  TENG F，GUO L，CUI T，et al.CDetection：CRISPR-Cas12b-based DNA detection with sub-attomolar sensitivity and single-base specificity [J].Genome Biology，2019，20：132.

（责任编辑：顾浩然，包震宇）