肉制品中杂环胺检测与抑制的研究进展

温平平，夏超，于小番，许慧卿

(扬州大学 食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127)

Widmark[1]最先在高温烤制的马肉提取液中发现了可增加小鼠患癌率的物质，到20世纪70年代，Sugimura等[2]在烤鱼和烤牛肉中确定了致癌物杂环胺的存在，之后Commaner等[3]进一步确定了杂环胺的种类，Gross等[4]提出用固相萃取对杂环胺进行定量检测的方法。随着科学技术的进步，人们对杂环胺的研究逐步深入，杂环胺对人体健康的影响也逐渐受到重视，近年来，专家们还发现杂环胺可以诱发机体突变、产生肿瘤，其毒性能力比黄曲霉毒素、苯并芘强百倍甚至上千倍，对人体健康造成极大威胁。

基于此，本文主要介绍了肉制品中杂环胺的检测方法和抑制手段，杂环胺的检测方法中高效液相色谱-质谱法最为常用，其优势在于样品处理简单、操作自动化、分离速度快；杂环胺的抑制主要是从杂环胺的形成源头以及体内调控两方面介绍，以期为杂环胺引起的健康问题提供基础性的理论指导。

1 杂环胺的分类

目前已知的杂环胺有30多种，按结构分为氨基咪唑氮杂环胺和氨基咔啉类杂环胺；按形成温度不同分为热反应杂环胺(150～250 ℃)和热解杂环胺(>250 ℃)；按化学性质分为极性和非极性杂环胺(IQ型和非IQ型杂环胺)，其中非极性杂环胺的致癌、致突变性比极性杂环胺弱，详情见表1。

表1 杂环胺分类表[5]Table 1 The classification table of heterocyclic amines

续 表

2 杂环胺的形成机制

2.1 热反应杂环胺的形成机制

热反应杂环胺的形成主要是通过Maillard反应的中间过程和自由基途径产生。喹啉和喹喔啉类杂环胺的形成途径：一种是肉制品在高温加热过程中游离氨基酸和糖类发生脱水、环化形成乙烯基-吡啶/吡嗪，肌酸转化成肌酸酐，二者同Strecker降解过程中生成的醛类发生醇醛缩合形成杂环胺[6]；另一种是由Kikugawa[7]、Kato等[8]在Pearson等[9]的研究基础上得到的杂环胺自由基形成机制，即糖类与氨基酸在Maillard反应未发生Amadori重排前，通过形成吡嗪、吡啶和碳中心自由基进一步产生吡嗪、吡啶衍生物，最后同肌酸酐反应形成杂环胺。PhIP的形成前体是苯丙氨酸和肌酸酐，苯丙氨酸为PhIP的吡啶部分提供碳原子，肌酸酐则形成PhIP的咪唑部分，其形成也是在Maillard反应过程中完成的[10]。

2.2 热解杂环胺的形成机制

热解杂环胺多认为是通过蛋白质或氨基酸的高温热解形成。Norharman和Harman的形成反应类似,其前体都是葡萄糖和色氨酸。色氨酸在Amadori重排后通过脱水、β-消去反应等形成氧鎓离子,氧鎓离子经C-C键断开后进行分子间取代反应生成杂环胺。

2.3 结合态杂环胺的形成

结合态杂环胺是蛋白质与游离态杂环胺结合形成的加合物，其形成方式主要是蛋白质或氨基酸中的羧基与游离态杂环胺中的氨基反应形成酰胺键，最终形成二者的加合物，即结合态杂环胺。结合态杂环胺对人体健康的潜在威胁性在于它可通过人体内的消化酶作用转化为有害的游离态杂环胺[11]。

3 杂环胺的分析方法

3.1 样品提取

杂环胺的提取方法有溶剂萃取、固相萃取、固相微萃取和超临界流体萃取等。溶剂萃取法是利用杂环胺的溶解性进行分离，如Charles等[12]使用甲醇作为溶剂的加压加速溶剂萃取器萃取杂环胺，Holland等[13]建立了快速简便的串联溶剂固相萃取方法实现杂环胺分离；固相萃取法最早由Gross等提出，主要包括样品碱化→硅藻土、蓝棉等吸附剂及乙酸乙酯、二氯甲烷等有机试剂混合萃取→采用串联的PRS(丙基磺酸)和C18固相萃取小柱作为阳离子交换剂对提取的杂环胺进行纯化分离3个阶段。与溶剂萃取法相比，其优势在于溶剂消耗较低、可高效去除干扰物质，是目前最常见的HAAs样品前处理方法，如Zhang Yuan等[14]使用固-相萃取结合超高效超临界流体色谱与串联四极杆质谱联用在7 min内分离出肉制品中的杂环胺；固相微萃取是利用涂有固定相的熔融石英纤维涂层来吸附、富集待测组分的纯化方法。其优势在于集待测样的萃取、浓缩于一体，极大地加快了检测和分析速率，且可以实现超痕量分析[15]，如Zhang Qianchun等[16]建立了SPME-HPLC方法测定牛、羊肉中的5种杂环胺，检出限为0.10～0.15 ng/kg；超临界流体萃取是采用超临界流体作为萃取剂从样品中萃取特定成分以实现样品分离纯化的萃取技术，Fernando等[17]基于超临界流体萃取程序，通过毛细管电泳和荧光检测法对肉类样品中的6种非极性杂环胺进行分析测定。

3.2 杂环胺的检测

3.2.1 气相色谱-串联质谱法(GC-MS)

GC-MS集气相色谱的优良分离性和质谱法的高选择性优势为一体，该方法检测所需的样品量少，检出限可达到ng级别[18]，可用于检测较低含量的杂环胺或基质复杂的样品中的杂环胺。Warzecha等[19]利用GC-MS检测技术对10种肉样进行杂环胺检测并测出IQ、MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx和PhIP 5种杂环胺，总含量为1.9～77.4 ng/g。其弊端为检测前需衍生化处理待测样且不能检测热不稳定的化合物。

3.2.2 高效液相色谱-质谱法(LC-MS)

LC-MS不需要衍生化处理就可以对杂环胺进行定性、定量分析，且具有分离速度快、操作自动化等优势，因此在杂环胺的检测中被广泛应用。高效液相色谱可与荧光检测器(FLD)、紫外检测器(UV)、电化学检测器(ED)和二极管阵列检测器(DAD)等一个或多个检测器联用检测。Barcelo等[20]采用超高效液相色谱实现2 min内16种杂环胺的定性、定量检测；徐琦等[21]建立超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法检测了鱼肉制品中的12种杂环胺，实现杂环胺检测时的快速分离，其中检出限为0.3～1.0 μg/kg。

3.2.3 酶联免疫吸附测定法(ELISA)

ELISA是一种检测体液中微量物质的固相免疫测定技术，具有操作简捷、检测成本低等优点,尤其适合于复杂基质中的微量成分分析[22]。Martin等[23]制备了PhIP的4种结构类似物PhIP-1、PhIP-2、PhIP-3和PhIP-4的抗体,采用ELISA法研究了4种抗体之间的特异性和选择性；Sheng Wei等[24]开发了一种直接竞争ELISA法测定肉样中的IQ，检出限为2.7～3.3 μg/kg。

3.2.4 荧光检测法(FD)

FD是利用物质的荧光特性对待测物质进行定性、定量分析的方法。该方法具有价格便宜、检出限低、灵敏度高等优势，但只能检测具有荧光特性的物质，具有一定局限性。De Andrés等[25]建立了荧光检测法结合SFE-毛细管电泳对肉样中6种非极性杂环胺进行分析，发现其比一般的检测方法更快且可以有效避免待测物质中非荧光物质的干扰。

4 杂环胺的抑制及其机制

杂环胺的产生在蛋白质高温加热过程中是不可避免的，需要在不影响食物整体的感官品质的基础上将杂环胺的产生量降到最低或减弱其毒性，一方面可通过源头干预控制杂环胺的生成，另一方面则可通过体内调控来降低对人体的损害。

4.1 杂环胺的源头控制

4.1.1 提高科学技术，改进加工工艺

生产生活中可利用高新技术改进食品加工工艺，抑制杂环胺的生成，如Feng Ruihong等[26]采用蒸汽辅助焙烤的方式抑制了牛排中杂环胺的产生(IQ、Norharman除外)，曾茂茂等[27]基于酰胺类活性成分研究发明了降低游离态和结合态杂环胺含量的方法。

4.1.2 添加外源物质，清除自由基

杂环胺可通过自由基途径产生，因此添加具有清除自由基作用的外源物质一定程度上可以抑制杂环胺的生成。如Cheng Yiqun等[28]研究发现富含酚类化合物的甘蔗糖蜜提取物对炸鸡中杂环胺的形成有抑制作用并猜测可能与自由基途径有关；Keskekoglu等[29]研究葡萄籽提取物对4种不同加工技术的牛肉和鸡肉丸中杂环胺形成的抑制效果，研究结果表明，添加葡萄籽提取物是降低牛肉和鸡肉丸中杂环胺含量的重要因素且均与自由基清除能力有关。

4.1.3 抑制美拉德反应

美拉德反应在肉制品加热过程中扮演着重要角色[30]，多项研究表明，杂环胺是通过美拉德反应生成的，亚硫酸钠和有机硫化合物可通过阻碍美拉德反应的进行降低杂环胺的生成量。大蒜作为一种日常调味品，它含有大量的有机硫化物[31]，Tsai等[32]将大蒜和洋葱中天然存在的有机硫化合物注入猪肉中，发现可减少IQ、MeIQ等杂环胺的生成量;李利洁[33]在牛肉中加入槲皮素后检测到了槲皮素-苯乙醛加合物并发现这种加合物的存在对PhIP的形成具有抑制作用，可能与干预美拉德反应有关。

4.1.4 控制前体物的种类和数量

通过调整原料肉的加工方式使含前体物较多的肉汁液浸出以降低杂环胺的生成。如Felton等[34]用微波对牛肉进行预处理后发现杂环胺的生成量显著降低。Hasnol等[35]发现，通过抑制前体物苯丙氨酸、色氨酸等的含量可以有效抑制PhIP、Harman和Norharman的生成。

4.2 杂环胺的体内调控

杂环胺进入人体后可通过膳食纤维的吸附作用降低人体对杂环胺的吸收率，如Persson等[36]研究碳水化合物对杂环胺形成的影响,发现马铃薯和麦麸纤维可逆结合PhIP，进而抑制人体对杂环胺的消化吸收。经吸附作用后残余的杂环胺会随血液运送至肝脏,由CytP450依赖性单加氧酶催化生成N-OH-HAA化合物，进而产生致癌性物质，致癌活性物质与人体内营养物质结合形成加合物引起人体细胞损伤、生物活性功能丧失及致突变等问题[37]。因此可通过阻碍杂环胺加合物形成或将已经形成的杂环胺加合物切除修复来抑制杂环胺对人体的危害。Reis等[38]发现某些益生菌可与HAAs结合，阻碍杂环胺加合物的生成，使杂环胺失活并随益生菌通过粪便排出体外。Huber等[39]发现咖啡中的咖啡因可通过激活杂环胺解毒酶如谷胱甘肽S-转移酶(GST)和UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UGT)来减少杂环胺加合物进而抑制杂环胺的代谢。Ho等[40]认为在杂环胺加合物已经形成后可以通过基因修复，即切除基因中形成杂环胺加合物的部分以抑制杂环胺毒性作用的发生。

5 结语与展望

杂环胺主要存在于热加工肉制品中，但由于食品体系较为复杂，形成的杂环胺种类多，质量少，形成机制多样，种种因素导致杂环胺的研究难度较高。尽管现在国内外研究学者对杂环胺的研究范围较广，但具体性的研究较少，比如仅仅是研究某种加工方式或某种外源添加物对杂环胺的生成有抑制效果，但具体是通过何种途径及如何抑制缺乏深入研究，再者，研究者们多针对游离态杂环胺的生成和抑制进行研究，而结合态杂环胺作为存在于人体中的一个潜在风险因素却没有得到更多的关注，因此，研究结合态杂环胺在人体内的稳定性和控制措施也具有重要的研究价值。