外源钙对盐胁迫下罗汉果幼苗生理效应的影响

赵 英， 张佳佳， 吴 敏， 邓 平， 朱宇林*， 黄司翊

（1.玉林师范学院 生物与制药学院，广西 玉林537000； 2.西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌712100）

罗汉果（Siraitia grosvenorii）是葫芦科多年生藤本植物的果实，原产我国广西、广东、江西等省的热带、亚热带山区，是卫生部首批公布的药食两用的名贵中药材，富含罗汉果甜苷、多种氨基酸和维生素等［1］.常饮罗汉果茶，可预防多种疾病，现代医学证明，罗汉果对支气管炎、高血压等疾病有显著疗效，还能起到防治冠心病、血管硬化、肥胖症的作用.目前，广西拥有大面积的罗汉果种植基地，罗汉果也是当地农业经济收入的主要来源.

土壤盐碱化是影响全球农林业生产、发展和生态环境的重大问题，也是影响我国广西地区农林生产的主要因素之一，同时灌溉农业的发展和化肥使用不当等原因造成的次生盐渍土壤面积扩大，也严重限制了广西地区罗汉果种植产业的发展.盐胁迫会抑制植物生长，使农作物产量受到不同程度的影响.因此，提高植物的抗盐性，减少盐胁迫对于农作物的影响是人们普遍关注的话题.钙是植物所必需的营养元素，对维持细胞膜透性、离子运输、信号传导、调控酶活性等有重要作用，研究［2-5］发现Ca2＋参与多种逆境胁迫过程，如盐胁迫、高温胁迫、低温胁迫、氧胁迫等，可提高植物对逆境的适应能力.当植物受到外界胁迫时，细胞内Ca2＋浓度升高，可与钙调蛋白质结合成激活态复合体，激活基因表达，启动一系列反应使植物适应胁迫环境.华智锐等［6］研究发现施加适量浓度的外源钙能显著抑制盐胁迫下黄芩幼苗MDA的积累；周红菊［7］发现盐胁迫能明显降解叶绿素含量，外源钙能有效缓解盐胁迫对玉米幼苗叶绿素含量的影响；严蓓等［8］指出外源喷施Ca2＋可提高黄瓜幼苗的盐胁迫耐性；杨莎等［9］在研究外源钙对盐胁迫下花生幼苗的影响时，发现施加外源钙可以诱导花生幼苗抗氧化酶系统（CAT、POD和SOD）酶活性升高，祛除因盐胁迫造成积累的活性氧，降低活性氧对花生幼苗的破坏程度.然而，钙对植物盐胁迫的缓解效果因钙盐种类、浓度、不同植物种类等而不同，目前外源钙能否缓解盐胁迫对罗汉果幼苗的伤害及其适宜浓度，还未见相关报道.因此，本文拟研究不同浓度的外源钙对盐胁迫下罗汉果幼苗生理特性的影响，以期为罗汉果幼苗的盐渍栽培及品质提高提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料本实验于2019年4月15日上午9：00选用长势一致，株高为30 cm左右的一年生罗汉果幼苗，栽培在内径为20 cm，高为15 cm的普通花盆内，置于玉林师范学院农学院玻璃温室大棚，棚内昼夜温度分别为28和20℃，白天光强为1 200 μmol／（m2·s），相对湿度保持在60%±2.5%.培养土选用V（园土）∶V（基质）∶V（有机肥）＝1∶1∶1比例混合混匀，盆内土高12 cm，每个盆种植罗汉果幼苗1株，种植后土面上散上一层木屑起保水作用，在每株幼苗旁插上长120 cm的竹条，供幼苗攀爬.缓苗3周后开始盐胁迫试验.为保证幼苗健康生长，缓苗期土壤含水量为（25.4±1.23）%.

1.2 实验设计前期实验研究表明，罗汉果耐盐性较弱，120 mmol／L的NaCl浓度会对罗汉果幼苗造成显著影响，大于120 mmol／L的NaCl浓度甚至会造成幼苗死亡，本试验选择临界NaCl浓度120 mmol／L进行.试验于2019年5月11日在广西玉林师范学院玻璃温室大棚中进行，本试验采用完全随机试验，CaCl2浓度梯度分别为0、2、6、10、14和18 mmol／L（T1、T2、T3、T4、T5、T6），其中T1～T6为盐胁迫（NaCl）组，且盐胁迫浓度为120 mmol／L，以自来水处理为对照（CK），共计设置7个处理.胁迫处理14 d后，选择长势一致的幼苗，取植株中部生长一致的叶片，每个处理随机选取3株进行重复测定.具体试验处理见表1.

表1 试验处理设计Tab.1 Test processing design

1.3 实验方法参照叶宝兴［10］的测定方法，丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法.参照胡炳义等［11］的测定方法，可溶性蛋白含量的测定采用紫外吸收法测定.参照张志良［12］的方法，叶绿素（Chl）含量的测定采用丙酮提取法；脯氨酸含量采用磺基水杨酸法测定；过氧化氢酶（CAT）活性的测定，采用紫外吸收法；过氧化物酶（POD）活性的测定，采用愈创木酚法；超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定，采用用氮蓝四唑（NBT）光还原法.

1.4 数据统计与分析采用Excel 2007进行图表制作，运用统计分析软件SPSS 17.0对试验数据进行显著性检验，以P＜0.05为显著性标准.采用隶属函数值评价施加外源钙对罗汉果幼苗耐盐性的影响，若所测指标与罗汉果幼苗耐盐性呈正向关系，则隶属函数值计算公式为

若某一指标与盐胁迫耐性呈反向关系，可通过反隶属函数计算其隶属函数值

其中，U为某一处理下的某一指标的隶属值，X为某一处理生理生化指标参数的测定值，Xmin为该指标测定值中的最小值，Xmax为测定值中的最大值［13］.

2 结果与分析

2.1 CaCl 2对盐胁迫下罗汉果幼苗MDA含量的影响MDA是植物细胞膜质过氧化的产物之一，MDA含量不仅可以反映出组织内脂质过氧化的程度，还能间接反映植物细胞受损伤的程度［14］，在一定盐胁迫范围内可以作为鉴定植物耐盐性的生理指标［15］.由图1可知，浓度为120 mmol／L的盐胁迫下，罗汉果幼苗MDA含量显著升高（P＜0.05），施入不同浓度的外源Ca2＋均能显著降低罗汉果幼苗MDA的含量（P＜0.05），且随着外源钙浓度的提高，罗汉果幼苗MDA含量先降低后升高，当Ca2＋浓度为6 mmol／L时，MDA含量最低，与T1相比罗汉果幼苗MDA含量下降了45.53%，但仍显著高于CK（P＜0.05）；当外源Ca2＋浓度大于6 mmol／L时，罗汉果幼苗丙二醛含量显著增加，但仍小于T1中MDA的含量，说明不同浓度的外源钙能够缓解120 mmol／L浓度的盐胁迫对罗汉果幼苗的伤害，但存在一定差异.

图1 不同浓度CaCl 2对盐胁迫下罗汉果幼苗MDA含量的影响Fig.1 Effect of CaCl 2 concentration on malondialdehyde content of siraitia grosvenorii seedlings undersalt stress

2.2 CaCl2对盐胁迫下罗汉果幼苗可溶性蛋白的影响由图2可知，当受到盐胁迫时，罗汉果幼苗叶片可溶性蛋白含量显著增加（P＜0.05）.

图2 不同浓度CaCl 2对盐胁迫下罗汉果幼苗可溶性蛋白含量的影响Fig.2 Effect of CaCl 2 concentration on soluble protein content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

不同浓度的外源Ca2＋均可增加叶片可溶性蛋白含量，但增幅不同.随着外源Ca2＋浓度的增加，可溶性蛋白呈现出先增加后减小的趋势.

当Ca2＋浓度在6 mmol／L时，可溶性蛋白含量达到最大值（P＜0.05），与T1相比增幅达76.68%；当Ca2＋浓度大于6 mmol／L时，可溶性蛋白含量减小，但仍显著高于T1可溶性蛋白含量（P＜0.05），这可能是由于罗汉果幼苗在受到盐胁迫时，为适应生长环境而在体内合成了某种蛋白酶，以应对逆境下的不良影响.一定浓度的外源Ca2＋可以有效提高对盐胁迫下的罗汉果幼苗可溶性蛋白含量，降低渗透势，增大膨压，提高罗汉果幼苗抵御外界盐胁迫的能力，但当外源Ca2＋浓度大于10 mmol／L时，可溶性蛋白含量显著降低（P＜0.05），这可能是由于植物组织细胞内钙离子累积量过高，打破了细胞内的渗透调剂物质的平衡状态，从而抑制可溶性蛋白增加，说明不同植物种类对外源钙耐受力与生理反应不相同.浓度为6～10 mmol／L的CaCl2能显著增加浓度为120 mmol／L的盐胁迫下罗汉果幼苗可溶性蛋白的含量.

华智锐等［16］研究外源Ca2＋对盐胁迫下商洛丹参的影响，发现一定浓度的外源Ca2＋会使盐胁迫下丹参幼苗可溶性蛋白含量增加，这与本文研究结果一致.

2.3 CaCl 2对盐胁迫下罗汉果幼苗脯氨酸含量的影响脯氨酸作为重要的渗透调节物质，在维持植物体原生质稳定性上起着至关重要的作用.脯氨酸还可通过改善一些抗氧化酶活性、光合活性和植物生长，来增强植物的耐盐性［17-18］.如图3所示，罗汉果幼苗在120 mmol／L盐胁迫下，脯氨酸含量显著增加（P＜0.05）.

图3 不同浓度CaCl 2对盐胁迫下罗汉果幼苗脯氨酸含量的影响Fig.3 Effect of CaCl 2 concentration on proline content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

施入外源Ca2＋后，罗汉果幼苗脯氨酸含量随着Ca2＋浓度升高呈先升后降的趋势，且均显著高于CK和T1（P＜0.05）.外源Ca2＋浓度为6 mmol／L时，脯氨酸含量达到最大值，与T1相比增加了148.69%（P＜0.05）；外源Ca2＋浓度大于6 mmol／L时，罗汉果幼苗脯氨酸含量下降，与T1相比分别增加了124.92%、117.29%和112.67%.可见不同浓度的外源钙能够提高罗汉果幼苗脯氨酸的含量.

2.4 CaCl 2对盐胁迫下罗汉果幼苗叶绿素含量的影响叶片是植物进行光合作用的主要器官，叶绿素含量是影响植物光合作用的重要因素，叶绿素含量的高低在一定程度上反映植物进行光合作用的水平［19］.

由图4可以看出，120 mmol／L盐胁迫处理下，罗汉果幼苗Chl a、Chl b含量均显著降低（P＜0.05）；随着外源Ca2＋浓度的增加，Chl a、Chl b含量呈现先增加后减小的趋势；当外源Ca2＋浓度为6 mmol／L，Chl a、Chl b含量达到最大值，与T1相比分别增加了73.71%和31.36%；当外源Ca2＋浓度大于6 mmol／L时，Chl a、Chl b含量逐渐减少，T6处理下，罗汉果幼苗Chl a、Chl b含量最少.同时，120 mmol／L盐胁迫处理后罗汉果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b均显著低于CK（P＜0.05）.随外源Ca2＋浓度增加罗汉果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b呈先升高后降低，经方差分析T1～T4处理，其中T3处理后，罗汉果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b甚至超过对照CK，分别增加了6.42%和20.29%.T6处理下罗汉果幼苗Chl a＋b含量和Chl a／b均达到最低.

图4 不同浓度CaCl 2对盐胁迫下罗汉果幼苗叶绿素含量的影响Fig.4 Effect of CaCl 2 concentration on chlorophyll content of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

2.5 CaCl 2对盐胁迫下罗汉果幼苗叶片CAT、SOD和POD活性的影响由图5可知，与CK相比，120 mmol／L盐胁迫处理下，罗汉果幼苗POD、CAT活性显著增强，SOD活性显著降低（P＜0.05）.外源施加不同浓度Ca2＋，均能提高3种保护酶活性.随着外源Ca2＋浓度的增加，SOD、POD、CAT活性均先增强后减弱；不同浓度的外源Ca2＋均能显著提高120 mmol／L盐胁迫下罗汉果幼苗SOD和CAT活性；T2、T3处理下，罗汉果幼苗SOD、POD和CAT活性均随着Ca2＋浓度升高而升高，当Ca2＋浓度为6 mmol／L时，罗汉果幼苗体内SOD、POD和CAT活性达到最大，与T1相比增加显著（P＜0.05），分别增加83.53%、21.11%和78.81%；当Ca2＋大于6 mmol／L时，罗汉果幼苗SOD、POD活性显著降低（P＜0.05），CAT活性降低.T6处理下，罗汉果幼苗SOD、POD和CAT活性最低.

图5 不同浓度CaCl 2对盐胁迫下罗汉果幼苗抗氧化酶活性的影响Fig.5 Effect of CaCl 2concentration on SOD，POD，CAT activity of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

2.6 不同浓度外源钙对盐胁迫下罗汉果幼苗各指标的隶属度分析隶属函数值可分为4个等级，其等级代表植物适应环境的不同程度：不抗型（隶属值 ＜0.2）、弱抗型（0.2≤隶属值≤0.4）、中抗型（0.4≤隶属值≤0.6）、高抗型（0.6≤隶属值≤1）［20］.将外源钙对盐胁迫下罗汉果幼苗测定的10个指标生理指标参数的隶属函数计算加权平均值，综合评价外源钙对罗汉果耐盐性的影响，如表2所示.在CK～T6处理下，不同浓度CaCl2处理罗汉果幼苗的耐盐性综合排名

表2 不同浓度CaCl 2对盐胁迫下罗汉果幼苗各指标的隶属度分析Tab.2 Analysis of the subordinate degree of different concentrations of CaCl 2 on the indexes of Siraitia grosvenorii seedlings under salt stress

可见T1和T6处理属于弱抗型，T2、T5属于中抗型，CK、T3和T4属于高抗型.因此，缓解罗汉果幼苗盐胁迫最好的外源钙浓度为6 mmol／L.

3 结论与讨论

植物遭到盐胁迫时，活性氧代谢平衡被破坏，活性氧积累，自由基增加，生理指标发生不同程度的变化.文献［21］研究表明，Ca2＋是植物生长所必须的大量元素，是偶联胞外信号和胞内生理反应的第二信使，在调节植物细胞对逆境适应性过程中发挥着重要作用.Ca2＋可增加质膜的稳定性和钙信号系统的正常发生和传递，以维持细胞内离子平衡，降低质膜透性，组织胞内钾离子的外渗和钠离子的进入.MDA作为膜脂过氧化的主要产物，直接关系到植物细胞膜受损程度.本试验中盐胁迫处理下罗汉果幼苗叶片MDA含量升高，表明盐胁迫加强了植物细胞膜脂过氧化程度；施入不同浓度的外源钙后，MDA含量呈现先升后降的趋势，说明一定浓度的外源Ca2＋达到6 mmol／L时能够有效缓解盐胁迫对罗汉果幼苗的伤害，利于植物器官寿命的延长［22］.但当外源钙浓度过高时，这种缓解作用就被抑制，这与郑秀芳等［23］对马铃薯（Solanum tuberosumL.）的研究相一致.

可溶性蛋白、脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物质，这些物质含量的积累有利于植物耐盐性提高［22］.盐胁迫下，罗汉果幼苗通过提高自身渗透调节物质缓解盐胁迫带来的伤害，加入外源Ca2＋后受显著增强了罗汉果幼苗可溶性蛋白及脯氨酸含量.当外源Ca2＋浓度为6 mmol／L时，罗汉果幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量最高；说明适宜浓度的外源Ca2＋可以有效提高罗汉果幼苗可溶性蛋白及脯氨酸含量，罗汉果幼苗通过提高自身渗透调节物质抵御盐胁迫带来的伤害.

叶绿素含量在一定程度上反映植物同化物质能力的强弱［24］.盐胁迫对罗汉果幼苗叶绿素含量影响显著，盐胁迫下，罗汉果幼苗Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b均显著下降，这可能是由于盐胁迫下叶绿体中的光系统Ⅱ（PSⅡ）的光能捕获和用于电子传递的量子产额，从而影响了植物的光合性能［25］.导致盐胁迫下叶绿素含量会降低，施入不同浓度外源Ca2＋后，罗汉果幼苗Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b先增加后降低.当外源Ca2＋为6 mmol／L时，Chl a、Chl b、Chl a＋b含量和Chl a／b均达到最大值，这可能是因为一定浓度的外源Ca2＋能显著增强植物叶片抗氧化酶活性，清除活性氧，大大缓解叶绿素含量的分解，增强植物叶片对盐胁迫的适应性，提高植物叶片利用光的能力，这与刘丽等［26］研究结果一致.

盐胁迫下，SOD、POD、CAT作为植物抗氧化物保护酶，能够清楚自身多余的活性氧及自由基［27］.本文中罗汉果幼苗在120 mmol／L盐胁迫时，SOD活性减弱，POD、CAT活性增强，加入不同浓度的外源Ca2＋后，SOD和CAT活性均显著增强.POD除在T2处理后活性降低外，其余活性均显著增加，说明外源Ca2＋能有效提高罗汉果幼苗抗氧化酶活性，这与刘艺平等［28］的研究结果一致.当外源Ca2＋达到6 mmol／L时，SOD、POD、CAT活性均达到最高，说明浓度为6 mmol／L的外源Ca2＋能显著提高盐胁迫下罗汉果幼苗抗氧化酶活性.

经隶属函数综合分析表明，不同浓度CaCl2处理罗汉果幼苗的耐盐性综合排名为

可见，T1、T6处理属于弱抗型，T5、T2属于中抗型，T4、CK和T3属于高抗型.因此，外源钙浓度为6～10 mmol／L能显著缓解罗汉果幼苗盐胁迫，浓度为6 mmol／L效果最佳.