高效液相色谱法测定彩棉中棉酚旋光异构体含量

刘 俊， 李 洋， 李海涛， 曾 鲜， 姚 军*， 袁 洁

(1.乌鲁木齐海关技术中心，新疆乌鲁木齐 830063；2.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011；3.天津市理化分析中心，天津 300051；4.新疆医科大学厚博学院，新疆克拉玛依 834000)

自然生长且带有颜色的棉花称为天然彩色棉，主要包括棕色和绿色两种品系。我国新疆已成为世界最大的彩棉生产基地，占全国彩棉总量的95%，占世界彩棉总量的60%[1]。与普通白棉相比，彩棉色泽天然长成，加工过程无需印染，织物不残留有害化学物质，因而被誉为 “人类第二健康肌肤”，其纺织品具有广阔的市场前景。

棉酚(Gossypol)[2,3]是存在于锦葵科植物棉花的根、茎、叶和棉籽仁内的一种黄色多酚类化合物，因其结构中含有活性的醛基和羟基而具有毒性。棉酚分子结构中有一个手性轴，因而存在两种光学异构体，即左旋棉酚((-)-棉酚)和右旋棉酚((+)-棉酚)，两者毒性和药理活性均不相同[4,5]，因此常常需要对其进行拆分检测。由于棉酚的化学毒性，国家制定了棉籽油和棉粕饲料中棉酚的检测标准[6,7]。目前对棉酚的检测主要集中在棉籽[8,9]、棉籽油[10,11]和棉粕饲料[12,13]等方面，未有对棉花中游离棉酚对映体含量的检测。棉花作为纺织品原料，与人体皮肤接触，如果其棉酚含量较高，可能会对消费者的健康造成潜在的危害。因此，建立一种简单、快速的针对棉花基质中棉酚旋光异构体的检测方法具有重要的现实意义。

本研究选择超声提取法提取棉花基质中的棉酚旋光异构体，采用高效液相色谱法(HPLC)测定其含量。该方法操作简便，准确度高，精密度好，可用于新疆彩棉中棉酚旋光异构体的检测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)；TB-114型电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；YZ-250DB超声波清洗器(上海越众仪器设备有限公司)。

(-)-棉酚对照品(纯度>98%)、(+)-棉酚对照品(纯度>98%)均为课题组自制；D -(-)苏-1-对硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇(分析纯)、甲醇(色谱纯)、乙醇(分析纯)、磷酸(分析纯)均购自百灵威科技有限公司。

棉花样品共12种，其中棕色彩棉5种，绿色彩棉4种，普通白棉3种，依次编号为1#～12#，均购置于中国彩棉集团股份有限公司。

1.2 游离棉酚旋光异构体对照品衍生物溶液的制备[14]

精密称取(-)-棉酚和(+)-棉酚对照品各10.0 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加入2%的D -(-)苏-1-对硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇和10%冰HAc的N,N-二甲基甲酰胺溶液20 mL，于90 ℃水浴30 min，冷却至室温，用N,N-二甲基甲酰胺定容至刻度，即得400 μg/mL的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物混合对照品溶液。

1.3 棉花中棉酚旋光异构体供试品溶液的制备

称取剪碎的棉花样品1 g，置于研钵中，加入1%的HAc乙醇溶液20 mL，研磨10 min后倒入锥形瓶中，超声10 min，抽滤，滤液氮吹至2 mL，加入2%的D -(-)苏-1-对硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇和10%冰HAc的N,N-二甲基甲酰胺溶液20 mL，置90 ℃下水浴30 min，冷却至室温，用N,N-二甲基甲酰胺定容至25 mL棕色容量瓶中，即得。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温20 ℃；流动相：甲醇-2%H3PO4溶液(85∶15，V/V)。流速：1 mL/min，检测波长为235 nm，进样量10 μL。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

游离棉酚的极性较弱，本研究发现乙醇可以有效提取棉籽中的棉酚。由于游离棉酚结构中具有酚羟基，稳定性较差，实验发现游离棉酚在酸性条件下比较稳定，因此采用1%的HAc乙醇溶液作为提取溶液，使棉酚的稳定性大大提高，能满足后续分析测试的要求。

2.2 棉酚旋光异构体拆分方法的选择

本方法通过手性拆分试剂与(-)-棉酚和(+)-棉酚反应，生成的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物在ODS柱上可以有效分离。实验考察了分别采用(R)-(-)-2-胺基-1-丙醇，D -(-)苏-1-对硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇和(L)-(-)-2-氨基-3-苯基-1-丙醇对(±)-棉酚进行衍生化反应，结果表明，以D -(-)苏-1-对硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇作为手性拆分试剂，在10%冰HAc的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，90 ℃下水浴加热30 min，衍生化反应完全。

2.3 流动相的优化

由于棉酚呈现弱酸性，需要在流动相中添加弱酸抑制其解离，分别考察了甲醇-2%甲酸溶液和甲醇-2%H3PO4溶液作为流动相时色谱峰的情况，结果显示甲醇-2%H3PO4分离效果好。

2.4 专属性

取质量浓度分别为16.0 μg/mL的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物混合对照品溶液，及棉酚旋光异构体供试品溶液，按“1.4”色谱条件进样分析，得图1。由图1可知，对照品溶液中(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物和棉花供试品中(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物保留时间分别为22.5 min和12.1 min，其他成分无干扰。

图1 游离棉酚旋光异构体衍生物的色谱图Fig.1 Chromatograms of derivatives of free gossypol optical isomersA.Reference substance;B.Sample.1.Derivatives of (+)-gossypol;2.Derivatives of (-)-gossypol.

2.5 方法学考察

2.5.1 工作曲线精密吸取质量浓度为400 μg/mL的(-)-棉酚和(+)-棉酚衍生物混合对照品溶液5 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺溶液定容至刻度，经逐级稀释得质量浓度分别为0.128、0.64、3.20、16.0、80.0 μg/mL的棉酚旋光异构体衍生物系列溶液，按“1.4”色谱条件进样分析。以浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，得(-)-棉酚衍生物回归方程为:y=52 594x-1 761.9(r=0.9996)；(+)-棉酚衍生物回归方程为:y=35 839x-6 610.9(r=0.9990)。结果表明(-)-棉酚衍生物和(+)-棉酚衍生物在0.128～80.0 μg/mL范围线性关系良好。

2.5.2 精密度取3.20 μg/mL棉酚光学异构体溶液，按“1.4”色谱条件进样分析，平行测定6次，(-)-棉酚峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)分别为1.31%和1.42%，(+)-棉酚峰面积和保留时间的RSD分别为1.76%和1.63%。表明方法的精密度良好。

2.5.3 稳定性取1#棉花，按“1.3”方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h进样，按“1.4”色谱条件进样分析，不同时间下(-)-棉酚峰面积和(+)-棉酚峰面积的RSD值分别为1.78%和1.46%，保留时间的RSD值分别为1.63%和1.54%。表明样品溶液中棉酚旋光异构体在24 h内稳定。

2.5.4 重复性试验取1#棉花6份，按“1.3”方法制备供试品溶液，按“1.4”色谱条件进样分析，(-)-棉酚峰面积和(+)-棉酚峰面积的RSD分别为1.94%和1.37%，保留时间的RSD分别为1.78%和1.48%。

2.5.5 回收率试验取0.5 g的1#棉花样品9份，每组3份，在每组中分别加入3.20 μg/mL棉酚光学异构体对照品溶液2、3、4 mL，作为棉酚光学异构体低、中、高样品组，按“1.3”方法制备供试品溶液，按“1.4” 色谱条件进样分析，数据如表1所示。由表1可见检测结果的准确度较好。

表1 棉酚旋光异构体加样回收率结果

2.6 实际样品检测

采用上述方法分析了新疆5种棕色彩棉、4种绿色彩棉及3种白棉中棉酚光学异构体的含量，数据如表2所示。总体来看彩棉棉花中棉酚含量比白棉低，(+)-棉酚含量比(-)-棉酚含量低，白棉中棉酚最高含量为84.5 mg/kg，远低于棉籽中棉酚含量(1%左右)，也低于国家标准中棉籽油中棉酚的限量0.02%。另外由于棉酚属于极性较小的化合物，难溶于水，随汗液吸收进入人体的量非常有限，因此可以说明棉花中微量棉酚不会对消费者的健康造成影响。

表2 不同品种棉花中棉酚光学异构体含量(mg/kg，n=3)

3 结论

建立了手性拆分试剂柱前衍生化高效液相色谱法测定新疆彩棉中棉酚光学异构体的含量，该方法样品前处理简单，操作简便，准确度高，精密度好。通过对9种新疆彩棉花样品和3种白棉样品进行棉酚含量测定，总体来看彩棉棉花中棉酚含量比白棉低，(+)-棉酚含量比(-)-棉酚含量低，白棉中棉酚最高含量为0.00845%，低于目前棉籽油中棉酚限量为0.02%。