葫芦[8]脲作为流动相添加剂的高效液相色谱法测定牛奶中喹诺酮药物

2021-07-14吴玉田周贻兵刘利亚

分析科学学报 2021年3期

吴玉田，周贻兵，李磊，张权，林野，刘利亚

(贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳 550004)

喹诺酮类药物是全合成抗菌素，这类抗生素主要通过抑制细菌DNA旋转酶作用，阻碍DNA复制，从而使细菌死亡。因其成本低廉，抗菌谱广、抗菌作用强，被广泛用于人以及畜禽感染性疾病的治疗和预防[1]。随着社会高速发展，人们在养殖过程中不严格遵守抗生素药物用量，致使牛奶等动物源性食品中抗生素类药物残留日趋严重。因此，建立牛奶中喹诺酮类药物的高效准确测定方法，了解喹诺酮残留水平，对维护人民健康具有重要意义。

冠醚、环糊精等大环化合物的特殊空腔结构使其能通过范德华力、氢键、配位作用等与尺寸合适的有机分子，或可质子化的基团，如胺基、羟基等离子型化合物发生主客体相互作用形成配合物[2,3]。其中，环糊精作为流动相添加剂，用于提高液相色谱灵敏度和分离度，得到了广泛研究[4 - 6]。葫芦脲是将苷脲单元通过亚甲基桥联起来的新型大环化合物[7,8]，从结构上看葫芦脲具有疏水性空腔，而左右两个端口均匀分布着具有极性的羰基氧原子，这种特殊的分子结构使得葫芦脲能够与大量客体小分子自组装，从而形成葫芦脲主客体化合物[9,10]。葫芦脲也是一种潜在的优良流动相添加剂，山西师范大学杜黎明课题组已经成功将葫芦[7]脲作为流动相添加剂，用于检测金鸡丸中的黄藤素和黄连素[11]。黄藤素和黄连素被限制在葫芦[7]脲的空腔中，其辐射转移的可能性降低，荧光强度增加，提高了该方法的灵敏度。葫芦脲家族中的葫芦[8]脲(Q[8])具有高聚合度和较大的疏水空腔和极性端口，有望能与喹诺酮分子相互作用形成稳定的包结配合物[12,13]。本研究考察了以葫芦[8]脲作为流动相添加剂的高效液相色谱(HPLC)法测定喹诺酮药物，实验优化了色谱条件，并应用于实际样品的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 2695型高效液相色谱仪，配Waters 2475荧光检测器(美国，沃特世公司)；Sigma 3-18K离心机(德国，西格玛公司)。

葫芦[8]脲(Q[8])为实验室自制合成。氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、西诺沙星标准品均购于德国Dr.Ehrensorfer公司；甲酸、甲醇和乙腈为色谱纯，均采购于美国Fisher Chemical公司。实验用水为Millipore A10超纯水机(美国密理博公司)制备的超纯水。

1.2 标准溶液

分别称取氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、西诺沙星标准品(纯度大于99.5%)各10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，浓度1 mg/mL，于-18 ℃冰箱保存，用时稀释。

1.3 色谱分析条件

色谱柱为Waters C18柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相为甲醇-0.05 mmol/L葫芦[8]脲水溶液(含0.2%甲酸)，梯度洗脱条件见表1。流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量20 μL。荧光检测器检测，激发波长290 nm，发射波长470 nm。

表1 甲醇-葫芦[8]脲水溶液梯度洗脱条件

2 结果与讨论

2.1 流动相条件的优化

喹诺酮是一类含氮杂环化合物[14]，喹诺酮分子含有可离子化的氨基和羧基结构，因此流动相的酸度对其色谱行为有显著的影响[15,16]。通过实验发现，当流动相的水相中未添加甲酸时，多种化合物的色谱峰出现分叉，而随着添加甲酸的量增加峰形变得尖锐、对称(图1)。考虑到色谱柱对甲酸的耐受度，拟定甲酸的添加量为0.2%。比较了流动相中有机相分别为乙腈和甲醇的分离与保留效果，发现使用乙腈作为有机相洗脱时会产生较多杂峰，而使用甲醇时杂峰较少，分离度较高。研究发现，葫芦[8]脲在甲醇中溶解度高于乙腈，因此乙腈作为流动相时，可能会造成葫芦[8]脲与喹诺酮的包结作用不完全，产生杂峰。考虑到葫芦[8]脲的分子量较大，添加后会带来液相系统的压力升高，因此本方法最终采用甲醇-0.05 mmol/L葫芦[8]脲水溶液(含0.2%甲酸)进行梯度洗脱。

图1 西诺沙星色谱图Fig.1 Chromatogram for the cinoxacinA.methanol-water;B.methanol -0.2% formic acid.

2.2 添加葫芦[8]脲效果的比较

考察葫芦[8]脲作为流动相添加剂的效果，在同样的流动相条件下，实验对比添加与不添加葫芦[8]脲的分离效果。如图2所示，当流动相中加入了葫芦[8]脲之后较未添加的峰形更好，柱效高，分离度更好。故本实验应用葫芦[8]脲作为流动相添加剂。

图2 喹诺酮混标色谱图Fig.2 Chromatograms for the quinolone.A.methanol-0.05 mmol/L cucurbit[8]uril aqueous solution(with 0.2% formic acid);B.methanol-water(with 0.2% formic acid)1.Ofloxacin;2.Pefloxacin;3.Norfloxacin;4.Ciprofloxacin;5.Sarafloxacin;6.Cinoxacin.

2.3 实际样品的测定

2.3.1 样品前处理精确称取牛奶样品2.000 g于50 mL离心管中，加H3PO4100 μL，乙腈4 mL，涡旋振荡提取，高速离心，取出上清液后加入5 mL正己烷，涡旋1 min，静置，去除下层清液。残渣中加入4 mL 乙腈，重复提取一次，上清液经同一份正己烷分配，合并两次提取液，氮吹至近干，初始流动相定容至1 mL，过滤膜后，待测。

2.3.2 工作曲线及检出限将氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、西诺沙星的标准储备液用甲醇稀释成质量浓度分别为400、200、160、120、80.0、40.0、20.0 ng/mL系列混合标准溶液，在“1.3”色谱条件下进样分析，以喹诺酮质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标做标准工作曲线，线性回归方程的R2均大于0.9985，以3倍信噪比(3S/N)计算得到检出限为5～10 μg/kg。具体见表2。