高效液相色谱-原子荧光光谱法测定土壤中4种有效硒形态

2021-07-14李爱民范俊楠贺小敏

分析科学学报 2021年3期

李爱民，范俊楠*，贺小敏，杨登

(1.湖北省生态环境监测中心站，湖北武汉 430072；2.湖北省生态环境厅恩施州生态环境监测中心，湖北恩施 445000)

硒是地壳中含量比较低的分散元素，其丰度约为0.13 mg/kg。硒是人体必需的微量元素之一，具有增强人体免疫力，提高人体抗癌能力，拮抗镉、砷、汞等有害重金属，调节蛋白质的合成等多种生理功能，缺硒或摄入过量硒都会引发一系列疾病，对健康造成危害[1,2]。硒在土壤中有多种存在形态，其中能直接被植物吸收利用的称为生物有效硒，是植物硒的重要来源，而植物源性含硒食品又是人体硒营养的重要来源[3]。研究发现，植物含硒量与土壤的含硒量没有显著相关性，但与土壤有效硒含量相关性显著[4,5]。因此，检测土壤中不同形态的有效硒含量水平，对研究不同形态有效硒的生物可利用性具有重要意义。

环境中有效硒主要包括硒酸根、亚硒酸根和有机硒小分子物质，其中有机硒小分子物质包括硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、甲基硒半胱氨酸和硒肽等。由于有效硒含有多种不同化学形态，因此需要采用不同分离技术与检测方法联用，以达到有效硒形态的分离检测，这是目前硒形态分析的发展趋势[6,7]。高效液相色谱-电感耦合等离子质谱联用技术，虽然具有灵敏度高、检出限低、线性范围宽等优点，但是仪器价格昂贵，难以推广。相比较而言，原子荧光光谱法检测硒元素已有现行的国家和行业标准，在灵敏度、检出限等方法性能上与电感耦合等离子质谱法基本相当甚至更优。本实验建立了高效液相色谱-原子荧光光谱测定土壤中4种有效的硒形态，能满足对硒检测的实际需求，具有推广应用价值。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-原子荧光光谱联用仪(聚光科技(杭州)股份有限公司)，配SAP-50-LC型形态分析液相色谱装置、AFS-9330型原子荧光光度计、Autosampler 5500型自动进样器；UPR-11-20L型超纯水器(四川优普超纯科技有限公司)；THZ-C型台式恒温振荡器(太仓市华美生化仪器厂)；JA1103N型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)。

标准物质：硒酸根标准溶液(0.525 μmol/g，以Se计)，亚硒酸根标准溶液(0.543 μmol/g，以Se计)，硒代胱氨酸标准溶液(0.560 μmol/g，以Se计)，硒代蛋氨酸标准溶液(0.499 μmol/g，以Se计)，均购于中国计量科学研究院。HCl、甲酸、氨水、KOH、KI、KBH4、(NH4)2HPO4、KH2PO4均为分析纯，购于国药集团药业股份有限公司。实验用水满足国家标准(GB/T 6682-2008)一级水要求。

1.2 样品制备与测试

按照(HJ/T 166-2004)《土壤环境监测技术规范》要求，采集筛选出湖北省恩施州恩施市芭蕉侗族乡(样品代号SMP01)、新塘乡双河镇渔塘坝村(样品代号SMP02)、西河坝种植基地(样品代号SMP03)、三岔乡莲花池村(样品代号SMP04) 4个不同酸碱度地区的土壤样品，自然风干后，研磨、过60目筛，储存于棕色玻璃瓶中，备用。称取制备好的土壤样品1 g(精确到0.001 g)，置于15 mL离心管中，加入10 mL 0.10 mol/L KH2PO4溶液，于恒温振荡器上30 ℃、350 r/min振荡提取120 min，再以3 000 r/min离心15 min后，取上清液过0.45 μm滤膜。滤液按照仪器工作条件测定，以目标化合物保留时间定性，外标法定量。

1.3 仪器条件

液相色谱条件：Hamoltion PRP-X100 离子交换柱(250 mm×4.1 mm，10 μm)；流动相为40 mmol/L(NH4)2HPO4溶液(pH=6.0)；洗脱方式为等度洗脱，流速为1.0 mL/min；进样体积为100 μL。

原子荧光光谱条件：空心阴极灯负高压为290 V、总电流为90 mA，辅阴极电流为45 mA；载气流量为400 mL/min；屏蔽气流量为600 mL/min；原子化器高度为8 mm；原子化器温度为200 ℃。

2 结果与讨论

2.1 提取条件选择

土壤中有效硒的提取主要是提取水溶态硒和可交换态硒。水溶态硒的提取一般采用去离子水或中性KCl溶液浸提[8,9]；可交换态硒的提取一般采用KH2PO4溶液、KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液浸提[10]。也有文献报道其它基质中有效硒的提取采用HCl、NaOH溶液等浸提[11,12]。本文直接采用标准(NY/T 3420-2019)《土壤有效硒的测定氢化物发生原子荧光光谱法》中的提取条件，用0.1 mol/L的KH2PO4溶液为提取溶液，不同酸碱度土壤的提取溶液pH值参考表1进行调节。

表1 不同酸碱度土壤的提取液pH值

2.2 液相色谱条件优化

2.2.1 色谱柱和流动相不同形态有效硒分离常用离子交换色谱柱和C18色谱柱两种色谱柱。相比而言，离子交换色谱柱对不同形态硒的分离效果较好[13,14]；采用的流动相有Tris缓冲溶液、(NH4)H2PO4、柠檬酸、甲醇-四丁基溴化铵-(NH4)H2PO4等[15,16]。而(NH4)2HPO4洗脱不同形态硒的色谱峰形更尖锐[17]。本文比较了Hamoltion PRP-X100柱(250 mm×4.1 mm，10 μm)和Athena-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)两种色谱柱，分别以40 mmol/L (NH4)2HPO4、40 mmol/L柠檬酸、40 mmol/L甲酸、2%甲醇+0.5 mmol/L四丁基溴化铵+40 mmol/L(NH4)H2PO4为流动相，对100 μg/L的4种形态有效硒的分离情况。结果表明：采用Hamoltion PRP-X100离子交换色谱柱，以(NH4)2HPO4为流动相，分离效果更好，实验结果与文献报道一致。

2.2.2 流动相浓度选择本文分别以10、15、25、40、50 mmol/L (NH4)2HPO4溶液为流动相，用20%甲酸溶液调节pH至6.0，流动相浓度对4种有效硒形态分离影响见图1。结果表明：随着(NH4)2HPO4浓度的增加，硒酸根的保留时间缩短和信号响应值增大明显；同时磷酸盐含量增加，容易造成色谱柱压升高，影响色谱柱使用寿命。40 mmol/L(NH4)2HPO4能在20 min内将4种有效硒形态较好分离。因此(NH4)2HPO4浓度选择为40 mmol/L。

图1 流动相浓度对4种有效硒形态保留时间的影响Fig.1 Effect of mobile phase concentration on the retention time of four available selenium species

2.2.3 流动相pH值选择不同形态有效硒在不同的酸碱度的溶液中，以阳离子、阴离子或两性离子状态存在，因此流动相的酸碱度对硒形态的分离效果影响很大。实验以40 mmol/L的(NH4)2HPO4溶液为流动相，用20%的甲酸溶液调节pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，流动相pH值对4种有效硒形态分离影响见图2。结果表明，流动相的pH对各硒形态保留时间有影响，尤其对硒酸根影响较大，随着实验pH值的增加，硒酸根的保留时间缩短明显；当pH大于6.0时，除了亚硒酸根形态的有效硒信号响应有减小的趋势。因此选择流动相pH值等于6.0。

图2 流动相pH值对4种有效硒形态保留时间的影响Fig.2 Effect of pH value of mobile phase on the retention time of four available selenium species

2.3 原子荧光光谱条件优化

2.3.1 KBH4浓度选择考察了KBH4的浓度对硒还原效果影响，结果见图3。当KBH4的质量浓度在10.0～20.0 g/L时，随着浓度的增加，4种形态有效硒的荧光强度显著增大；当KBH4的质量浓度大于20.0 g/L时，4种有效硒形态的荧光强度增幅不大，同时随着KBH4质量浓度的增加，会导致仪器背景噪声增强。选择KBH4质量浓度为20.0 g/L。

图3 KBH4浓度对4种有效硒形态响应的影响Fig.3 Effects of KBH4 concentration on the signal response of four available selenium species

2.3.2 KI浓度选择考察了KI的浓度对荧光强度的影响，结果见图4。当KI质量浓度在1.0～10.0 g/L时，随着浓度增加，亚硒酸根和硒酸根的荧光强度增大；硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸荧光强度减小；当KI质量浓度大于10.0 g/L时，4种有效硒形态的荧光强度变化较小，说明此时硒酸根还原成亚硒酸根的效率已接近最大。选择KI浓度为10.0 g/L。

图4 KI浓度对4种有效硒形态信号响应的影响Fig.4 Effects of KI concentration the signal response of four available selenium species

2.4 校准曲线及检出限

配制含硒酸根、亚硒酸根、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸的校准溶液系列，校准系列浓度见表2。将标准系列浓度由低至高的顺序按照“1.3”实验条件测定，以浓度为横坐标，荧光强度响应峰面积为纵坐标，绘制校准曲线。 4种有效硒形态的保留时间、校准曲线方程和相关系数见表3。依据(HJ 168-2010)《环境监测分析方法标准制修订技术导则》，实验室空白样品中未检测出目标物质可采用样品加标，加标浓度为估算检出限的2～5倍，按照样品分析的全部步骤测定7次，计算方法检出限(表3)。

表2 4种有效硒形态的校准浓度系列(μg/L)

表3 4种有效硒形态的保留时间、校准曲线及检出限

2.5 方法精密度和准确度

对样品SMP01～SMP04添加两个不同浓度4种硒标准品，硒代胱氨酸、亚硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根添加浓度分别为0.5、0.25、1.0、0.25 mg/kg和2.0、1.0、3.0、1.0 mg/kg，按照建立方法测定，计算6次测定的相对标准偏差(RSD)和加标回收率。实验结果表明：4种形态有效硒的实验室内的RSD范围为1.2%～13.7%，加标回收率范围为67.6%～94.7%。

2.6 样品测试

依据(NY/T 1104-2006)《土壤中全硒的测定》和(NY/T 3420-2019)《土壤有效硒的测定氢化物发生原子荧光光谱法》测定土壤样品SMP01～SMP04全硒和有效硒，采用“1.3”条件测定土壤样品SMP01～SMP04中4种有效硒形态，结果见表4。实验结果表明：样品SMP01～SMP04中有效硒含量占全硒含量的13.1%～33.3%；土壤中有效硒存在形态以硒酸根和亚硒酸根为主，分别占35.1%～46.5%和8.8%～38.2%；硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸未检出。