超高效液相色谱-串联质谱结合内标法快速检测毛发中15种毒品及代谢物

2021-07-14胡骏杰郝敬梅上官国强

分析科学学报 2021年3期

胡骏杰，郝敬梅，刘飞，杜乐，朱军，上官国强

(1.济宁医学院司法鉴定中心，山东济宁 272067;2.济宁医学院法医学与医学检验学院，山东济宁 272067;3.南京大学化学化工学院，生命分析化学国家重点实验室，江苏南京 210023)

自2016年11月国家禁毒办对《吸毒成瘾认定办法》修订以来，毛发中毒品及代谢物的检测结果已被作为吸毒成瘾认定的新标准[1,2]。个体在吸食或注射毒品后，相关成分及代谢物进入毛发并稳定储存在其中[3]。相较于血液、尿液、唾液等常规生物检材，毛发具有检测窗口期长、易于采集和便于保存等特点[4 - 6]。从某种程度上说，每段发丝就像一台“时光机”，记录着各种药毒物的代谢情况，可追溯长达几个月甚至几年的涉毒行为[7]。因此，高效精准毛发分析方法的建立，对掌握毒品代谢规律、顺利开展禁毒工作意义重大。

毒品及代谢物的分析主要包括气相色谱-质谱(GC-MS)法[8,9]和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[10 - 12]。近年来随着LC-MS/MS仪器性能的提升，该方法已被作为毛发中毒品分析的“首选”及“优选”[13,14]。但目前毛发分析技术仍面临前处理流程繁琐、痕量结果确证困难等挑战。基于此，本研究采用具有较高效率的高动能研磨法处理毛发检材，并对提取流程进行了简化；建立基于QTRAP质谱系统的分段多反应监测(Scheduled MRM,sMRM)、信息依赖性采集(IDA)、增强离子扫描(EPI)模式联用的分析方法：结合EPI谱库检索对毛发中15种毒品及代谢物进行确证；通过加入内标监测仪器及样品状态，同时实现对相关化合物的定量检测。该方法样品前处理简便快捷，分析流程快速高效，检测结果准确灵敏，可为毛发中毒品的系统性筛查提供强有力的分析手段。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Biotage Lysera高效样品破碎仪(瑞典，Biotage公司)；超高效液相色谱-串联质谱系统：岛津LC-30A型超高效液相色谱仪(日本，Shimadzu公司)串联SCIEX QTRAP 5500质谱仪(美国，AB SCIEX公司)。

苯丙胺、甲基苯丙胺、3,4-亚甲基二氧基苯丙胺(MDA)、3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)、甲卡西酮、氯胺酮、去甲氯胺酮、吗啡、O6-单乙酰吗啡、美沙酮、曲马多、芬太尼、Δ9-四氢大麻酚、可卡因、苯甲酰爱康宁、双苯戊二氨酯(SKF-525A，内标)标准品(质量浓度均为1.0 mg/mL)来自公安部物证鉴定中心，各化合物结构式见表1；NH4Ac(质谱级)、甲酸(色谱纯)、甲醇(色谱纯)购自德国Merck公司。实验用水为超纯水。

1.2 实验条件

色谱条件：Phenomenex Kinetex Biphenyl色谱柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)；流动相A：5 mmol/L NH4Ac-0.1%甲酸水溶液，流动相B：甲醇。梯度洗脱程序：0.0～1.0 min,5%B；1.0～1.5 min,5%～20%B;1.5～9.0 min,20%～95%B;9.0～11.0 min,95%B;11.0～11.1 min,95%～5%B;11.1～14.0 min,5%B。流速：0.5 mL/min；进样量：2 μL；柱温：40 ℃。

质谱条件：离子源：ESI源；扫描方式：sMRM-IDA-EPI，正离子模式；离子源参数：离子源电压(IS)：5 500 V；气帘气(CUR)：30 psi；雾化气(GS1)：50 psi；辅助气(GS2)：55 psi；离子源温度：500 ℃。15种毒品及代谢物和内标化合物的MRM参数见表1。

表1 15种毒品及代谢物及内标化合物结构式、MS/MS采集参数和保留时间

(续表1)

1.3 MS/MS谱库的建立

分别以50 eV、35 eV及20 eV三种碰撞能量在针泵直接进样模式下，对15种毒品及代谢物标准品溶液进行EPI扫描，建立相关物质的MS/MS谱库用于检索，为目标物确证提供支持。

1.4 样品前处理

将毛发样品置于离心管中，以适量超纯水和丙酮各振荡洗涤1次，取出晾干。准确称取25 mg毛发检材，置于含撞珠的研磨管中，依次加入500 μL甲醇，5 μL浓度为500 ng/mL的SKF-525A内标溶液，3 400 r/min转速下研磨破碎2 min。以0.22 μm有机相滤膜过滤研磨液后，进行UPLC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

2.1.1 提取溶剂的选择实验考察了甲醇、乙腈、超纯水3种提取溶剂对毛发中15种毒品及代谢物的提取效果。结果显示，乙腈对生物检材中的蛋白成分有较强沉淀作用，导致毛发角蛋白中包覆的毒品及代谢物成分回收率较低；由于部分毒品及代谢物成分在水溶液中的溶解度较低，因而超纯水提取效率低于甲醇。因此，甲醇对于毒品及代谢物成分的提取具有最广泛的普适性，实验选取甲醇作为提取溶剂。

2.1.2 前处理流程的简化对毛发检材的研磨方式分为干磨与湿磨，据文献报道湿磨法提取效果优于干磨法[15]，因此实验选择湿磨法。对含15种毒品及代谢物成分的毛发与甲醇混合研磨后，考察了超声处理对提取效果的影响。结果显示，对研磨管超声2 h后过滤研磨液，与研磨后直接过滤研磨液进行UPLC-MS/MS分析各物质提取效率无明显差别。因此，对毛发检材与提取溶剂研磨后直接过滤分析，简化了前处理流程，缩短了样品分析时间。

2.2 质谱方法的建立

2.2.1 MRM方法的建立配制浓度为50 ng/mL各目标物的单标准溶液，以针泵直接进样，确定各化合物母离子与子离子质荷比，优化去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)等参数，建立正离子模式下15种毒品及代谢物的MRM分析方法。

2.2.2 扫描模式的选择研究充分利用QTRAP 5500液-质联用系统复合质谱技术优势[16]，选取sMRM-IDA-EPI扫描模式，同时实现目标物的定性与定量分析。sMRM的检测窗口时间设置为120 s，这有利于在保留时间附近捕捉并锁定目标物，提高色谱峰响应值，同时作为IDA的预扫描，它将触发EPI扫描，获取相关物质的高灵敏二级谱图，通过EPI谱库检索用于检出物质的确证，对于毛发检材中痕量物质的分析具有重要意义。

2.3 液相色谱条件的优化

2.3.1 色谱柱的选择为确保各类化合物在色谱柱上有较好的保留及分离效果，实验考察了Phenomenex Kinetex Biphenyl柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)与Venusil MP C18柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)两种色谱柱的分离效果。结果显示，各化合物在Phenomenex Kinetex Biphenyl柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)上的分离效果明显优于Venusil MP C18柱，各目标物基本实现分离，峰形理想。

2.3.2 流动相的选择实验考察了甲醇和乙腈作为流动相中有机相对15种毒品及代谢物的分离效果。以甲醇作为流动相的有机相，在梯度洗脱程序下，考察了0.1%甲酸与0.1%甲酸加5 mmol/L NH4Ac对色谱峰峰形的影响。结果表明，流动相中NH4Ac的存在能明显改善各物质峰形。因此，实验选用5 mmol/L NH4Ac溶液(含0.1%甲酸水溶液)-甲醇作为流动相。方法优化后毛发基质中添加15种毒品及代谢物标准品和内标提取离子流色谱图如图1所示，其各自保留时间见表1。

图1 毛发基质中添加15种毒品及代谢物标准品和内标化合物的提取离子流(EIC)色谱图Fig.1 EIC chromatogram of 15 drugs,their metabolites and internal standard spiked in hair matrix

2.4 EPI谱库检索

分别在高、中、低三种碰撞能量下，对15种毒品及代谢物标准品进行EPI扫描，建立相关物质的EPI谱库。在实际样品检测中，将sMRM-IDA-EPI扫描模式下获取的EPI二级谱图，进行谱库检索匹配，全面对比各物质的离子碎片特征信息：例如，EPI谱库中甲基苯丙胺、氯胺酮、吗啡的MS/MS谱图(图2A1～A3)与毛发基质中对应物质的EPI谱图(图2B1～B3)具有高度一致性。实验中，sMRM 检测方式提供了最高的灵敏度与特异性，MS/MS谱图检索为相关物质的确证提供了可靠支持，二者为毒物筛查与定量分析提供了强大的技术保障。

图2 甲基苯丙胺、氯胺酮及吗啡的标准品(A1-A3)与毛发基质中加标样品(B1-B3)的EPI二级谱图Fig.2 EPI MS/MS spectra of standard(A1-A3) and hair-spiked(B1-B3) amphetamine,ketamine and morphine

2.5 方法性能指标

2.5.1 检出限、定量限、线性范围及回归方程准确称取25 mg洁净的空白毛发样品14份，置于研磨管中，并在各管中加入1 mL一系列浓度梯度的15种毒品及化合物混标溶液，以N2吹干，制备成含毒品及代谢物0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ng/mg以及5.0 ng/mg的7组毛发样品，每个浓度组设置两个平行样。将各样品按“1.4”流程前处理后，进行LC-MS/MS分析。以15种化合物定量离子对峰面积与SKF-525A定量离子对峰面积比值，对各物质含量作图并进行线性回归分析，得到回归曲线方程及相关系数，见表2。在0.05～5.0 ng/mg范围内，15种毒品及代谢物线性方程的相关系数R均大于0.995，方法检出限(S/N≥3)0.5～10 ng/g，定量限(S/N≥10)10～35 ng/g。之前文献中报道的毛发中毒品定量多采取外标法[10,16]，本研究采用内标法，以SKF-525A为内标，不仅可避免测定仪器、样品基质等因素带来的误差，提高准确度，还可通过内标物的峰形、峰面积等因素监测样品与仪器运行状态是否正常。根据2018年公安部颁布《涉毒人员毛发样本检测规范》规定，各物质检出限低于规定阈值，满足实际需要。

表2 15种毒品及代谢物线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.5.2 回收率与重现性分别在空白毛发中添加低、中、高浓度混标，制成含0.05、0.2、1.0 ng/mg毒品及代谢物的样品，每个浓度组设置6个平行样品，按照“1.4”方法流程处理，与标准提取添加样品做比，计算回收率，同时计算精密度。15种毒品及代谢物回收率在低、中、高三个添加浓度下回收率为89.2%～117.5%，相对标准偏差(RSD)为1.5%～7.1%，结果见表3。

表3 毛发中15种毒品及其代谢物的回收试验(n=6)

(续表3)

2.6 实际样品分析

从本实验室2020年6月接收的毛发检材中随机抽取10份，编号为101～110，采用本方法分析，获取MRM谱图及EPI谱图，并进行谱库检索比对，确证定性结果。进一步将检出物离子对峰面积与内标化合物峰面积之比带入标准曲线方程，计算相关物质含量。各样品检测结果见表4。108、109和110号样品未检出15种毒品及代谢物成分；101、102及103号毛发样品检出甲基苯丙胺，且102号样品检出代谢物苯丙胺，对应标准品及检出代谢物提取离子色谱图见图3A；104、105号样品检出吗啡；106、107号样品检出氯胺酮，其中107号样品氯胺酮含量较高，同时检出代谢物去甲氯胺酮，与标准品的提取离子色谱比对如图3B所示。

表4 毛发样品检测结果

图3 空白毛发中添加苯丙胺(A1)、去甲氯胺酮(B1)标准品(添加浓度0.2 ng/mg)与102号(A2)、107号(B2)样品中检出代谢物的提取离子色谱图(EIC)比对Fig.3 Comparisons of EICs of standard amphetamine(A1) and normeketamine(B1) spiked in blank hair(spiked concentrations:0.2 ng/mg),and detected metabolites in No.102(A2) and No.107(B2)