IL-15、IL-18、IL-21和NK细胞在梅毒血清固定患者外周血中的含量及临床意义

程文豪， 卢雨沫， 胡文龙， 刘忠伦， 任虹

(徐州医科大学附属连云港医院皮肤性病科，江苏 连云港 222000)

梅毒是由苍白密螺旋体引起的慢性传染性疾病，主要通过性接触传播。梅毒临床表现多样，且在全世界范围内广泛传播[1]。梅毒目前主要依靠血清学检查来诊断和评估治疗效果[2]，大部分梅毒患者在正规治疗后能达到临床治愈和血清治愈(非梅毒螺旋体抗原实验转为阴性)，但有些患者可表现为长时间梅毒血清学阳性，这种情况称为梅毒血清固定或血清抵抗[3-4]。近年来随着梅毒发病率的显著升高，血清固定的发生率也明显有随之升高趋势[5]。梅毒患者出现血清固定的机制尚不明确，近来研究发现，梅毒血清固定患者的免疫功能发生了转变[6]。

NK细胞是机体重要的免疫细胞，可以通过细胞毒机制直接杀伤病原体。NK细胞作为天然免疫系统的核心成员，在血清固定形成中发挥重要作用[7]。在免疫应答中，NK细胞增殖、分化、迁移等生物学效应受多种细胞因子的调节，其中IL-21[8-10]、IL-18[11-12]和IL-15[13-14]等细胞因子对NK细胞的调控作用尤为明显。本研究从细胞免疫方面入手，比较梅毒血清固定患者与健康者外周血IL-15、IL-18、IL-21和NK细胞变化水平，并分析其临床意义。

1 对象和方法

1.1 一般资料

选取2018年10月至2020年9月于徐州医科大学附属连云港医院皮肤性病科收治的24例梅毒血清固定患者为血清固定组，其中男10例，女14例，平均年龄(34.79±12.61)岁(17～58岁)。血清固定平均时间(5.88±6.52)年(1～31年)，快速血浆反应素试验(RPR)检测滴度1 ∶1者6例，1 ∶2者5例，1 ∶4者8例，1 ∶8者5例。一期梅毒产生血清固定4例，二期梅毒5例，潜伏梅毒15例(表1)。TRUST试验初始滴度为1 ∶2～1 ∶128。梅毒患者均经过规范的驱梅治疗和充分随访(一期梅毒、二期梅毒和晚期梅毒随访时间分别为1年、2年和3年)，RPR滴度维持在1 ∶1～1 ∶8之间超过3个月，排除生物学假阳性、再感染、神经梅毒、心血管梅毒等。选取性别与年龄相匹配的24例梅毒螺旋体颗粒凝集试验、RPR均阴性的健康体检者作为健康对照组，其中男、女各12例，平均年龄(34.75±11.81)岁(19～57岁)。受试者纳入标准：无严重感染性疾病、恶性肿瘤及免疫系统疾病，HIV抗体阴性，半年内未使用过免疫调节药物，排除妊娠期女性。本研究通过徐州医科大学附属连云港医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

表1 24例梅毒患者血清固定形成时间和滴度

1.2 主要试剂和仪器

CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC四色试剂，血细胞分析用溶血剂均为美国Agilen公司产品；人IL-15、IL-18、IL-21定量 ELISA 试剂盒(南京福麦斯生物技术有限公司)；Multiskan MK3型酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；EDTA-K2抗凝剂的真空采血管、BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪均为美国BD公司产品。

1.3 血样采集及处理

用含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管，清晨采集受试者空腹肘静脉血5 mL。取1 mL静脉血至干燥洁净的EP管内，做好标记(姓名、性别、年龄、采集时间)，室温放置保存，24 h内检测NK细胞水平。余4 mL静脉血，于30 min内，室温1 000×g离心15 min，取上层血浆，做好标记，于-80 ℃冰箱中保存，用于细胞因子IL-15、IL-18和IL-21水平检测。

1.4 ELISA法检测IL-15、IL-18和IL-21水平

将成倍稀释的不同浓度标准品和待测血浆分别置于相应微孔，每孔100 μL，并增加1孔作为空白对照孔，每组设2个复孔，37 ℃孵育90 min；洗板4次，每孔加入生物素化抗体工作液100 μL，37 ℃孵育60 min；洗板4次，每孔加入酶结合物工作液50 μL，37 ℃孵育30 min；洗板4次，每孔加入显色剂100 μL，37 ℃避光孵育10 min；每孔加入终止液100 μL，立刻用酶标仪在450 nm波长处测定各孔光密度值(D值)。以标准品D值和浓度绘制标准曲线(IL-15、IL-18和IL-21标准曲线R2分别为0.997 2、0.995 6、0.998 3)，计算样本浓度。实验步骤和方法均按照说明书严格执行。

1.5 流式细胞仪双标法检测外周血NK细胞水平

用反向加样法取50 μL静脉血加入流式管，再加入20 μL四色抗体试剂，轻轻充分混匀后，室温静置避光孵育15 min；然后加入450 μL红细胞溶解剂，混匀，室温静置避光孵育15 min，流式细胞仪检测。所有实验方法的操作规程参照试剂及仪器的说明书严格进行。

1.6 血清固定组和健康对照组患者外周血中NK细胞水平Meta分析

中文检索词以“血清固定或血清抵抗”和“自然杀伤细胞或NK细胞”为并列检索词，英文检索词为“serofast or seroresistance” and “natural killer cells or NK cells”。计算机检索中国知网、万方、维普、PubMed、EmBase、Cochrane Library等数据库，查找自建库至2020年10月关于NK细胞和梅毒血清固定的文献，检索语言不限。排除标准：不满足上述纳入标准的研究；纳入儿童、孕妇的研究；综述性文献；重复发表的文献；资料不完整的研究。提取的数据包括文章作者、发表年份、样本量和NK细胞比例(均数±标准差)。

1.7 统计学处理

采用Stata 15.0软件进行Meta分析，计算95%CI和标准化平均差(standardised mean difference，SMD)， 进行统计学异质性检验，若P>0.1、I2≤50%，表示各研究之间不存在异质性，采用固定效应模型进行分析；若P<0.1、I2>50%，表示存在异质性，采用随机效应模型进行分析。Egger′s检验评估发表偏倚。

2 结果

2.1 血清固定组与对照组外周血IL-15、IL-18和IL-21水平比较

由表2可见，血清固定组外周血IL-18和IL-21水平显著低于健康对照组(U=6.402，t=5.939，P均<0.001)。与健康对照组相比，血清固定组外周血IL-15水平稍低，差异无统计学意义(t=1.385，P=0.173)。

表2 两组外周血IL-15、IL-18、IL-21水平比较

2.2 血清固定组与对照组外周血NK细胞比例比较

流式细胞术检测结果显示，固定组外周血NK细胞比例[(17.57±5.23)%]明显低于对照组[(23.46±7.66)%，t=3.105，P=0.003]。见图1。

图1 流式细胞术检测血清固定患者与健康对照者外周血NK细胞表达水平

2.3 外周血中NK细胞水平Meta分析

鉴于本研究的样本量较小，通过检索策略检索到文献共267篇，按照文献的纳入和排除标准最终纳入16篇文献[15-30]进行Meta分析，纳入研究的基本特征见表3，加上本次实验数据，得到血清固定组655例，健康对照组586例。经同质性检验，各研究之间存在异质性(I2=92.20%，P<0.001)，故采用随机效应模型进行分析，结果显示与健康对照组相比，血清固定患者外周血NK细胞百分比明显减低[SMD=-0.64，95%CI(-1.08，-0.21)，P<0.001]。见图2。Egger′s 检验发现存在发表偏倚(P=0.296)。

表3 纳入Meta分析研究的基本特征

图2 血清固定组与对照组外周血NK细胞百分比Meta分析森林图

3 讨论

NK细胞在激活后迅速分泌大量细胞因子控制病原体的增殖，而且激活的速度和强度高于T细胞[31-33]。NK细胞在感染后可以迅速地被检测到，是评估机体细胞免疫功能的常用指标。近年来，国内外越来越多学者研究证实梅毒血清固定的发生与机体免疫受到抑制有关[34-35]。本实验结果显示，血清固定患者外周血中NK细胞比例明显低于健康对照组，提示血清固定患者免疫功能受到抑制，机体对梅毒螺旋体的免疫清除能力降低，可能引起血清固定。

既往有研究发现，与健康对照组相比，血清固定患者外周血中NK细胞水平明显降低[15，21]。然而，也有学者指出血清固定患者外周血NK细胞水平与健康对照组相比未见降低[17]。这些结果研究样本量均较小且结果并不一致，通过纳入16篇文献，加上本次实验结果，共对655例血清固定患者和586例健康对照者进行Meta分析。结果显示，血清固定组外周血NK细胞水平显著低于健康对照组。本Meta分析检索了国内外权威的中英文数据库，纳入所有关于NK细胞与梅毒血清固定，且符合标准的病例对照研究，但没有检索到国外的相关研究，仅展现国内地区NK细胞与梅毒血清固定相关性的研究情况。虽然结果也存在一定的异质性和发表偏倚，但是是对多个独立临床病例对照研究的荟萃分析，相较于单一临床病例对照研究，受试者更多，覆盖面更广，结果可信度更高。

既往关于血清固定与NK细胞的研究主要集中于外周血中NK细胞自身水平的变化[16，19]，本研究在检测NK细胞的同时，还探究了NK细胞上游细胞因子IL-21、IL-18和IL-15的水平；这些细胞因子可以独立或协同正向调节NK细胞的数量和功能[33]。结果显示，血清固定患者外周血中IL-21和IL-18水平明显低于健康对照组，这也在一定程度上支持了前文得出的血清固定患者外周血中NK细胞水平降低的结论；但IL-15水平差异无统计学意义，可能与样本量较小有关。

综上所述，本研究发现梅毒血清固定患者外周血中NK细胞及其上游细胞因子IL-18、IL-21含量降低，提示梅毒血清固定患者免疫功能受抑制，对梅毒螺旋体的免疫清除能力减弱，梅毒螺旋体残存于体内时间增长，可能是梅毒血清固定形成的原因之一。同时，外周血中NK细胞及其上游细胞因子IL-18、IL-21的含量或有望成为血清固定诊断的辅助指标。但目前研究的样本量较小，还需高质量、多中心、大样本进一步临床验证。