C14ORF169在结直肠癌中的表达及对化疗和预后的影响

罗婷怡， 孙伟， 杨庭松， 王士林， 霍钰虎， 韦海鸿， 徐彬

(同济大学附属上海市第十人民医院普外科，上海 200072)

结直肠癌是全球高发恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在所有癌症中分别位居第三位和第二位[1-2]。我国结直肠癌发病率和死亡率呈逐年上升趋势[3]。手术治疗早期结直肠癌效果较好[4]，而中晚期患者预后较差，5年生存率不足15%[5]，化疗耐药是其预后不良的主要原因之一[6]。C14ORF169是定位于人体14号染色体上的基因，其表达C14ORF169蛋白，又名NO66，是含十字形结构域蛋白(Jumonji domain-containing, Jmjd)去甲基化酶家族中的一员[7]，在组蛋白编码[8]和癌症的发生进展中起重要作用[9-11]。研究显示，C14ORF169在多种肿瘤中表达上调，包括肺癌[12]、肾癌[13]、前列腺癌[14]和神经胶质瘤[15]等，其高表达可促进肿瘤生长。Nishizawa等[16]发现，C14ORF169可能是结直肠癌新的预后标志物和潜在治疗靶点。然而，C14ORF169通过何种机制影响结直肠癌发生发展，以及其对结直肠癌患者预后的影响尚不清楚。因此，本研究利用Oncomine数据库，结合肿瘤相关的基因表达汇编(gene expression omnibus，GEO)数据，分析C14ORF169对结直肠癌患者预后的影响及其与临床病理参数的相关性，同时通过细胞实验探讨C14ORF169表达对结直肠癌患者化疗的影响。

1 材料与方法

1.1 数据筛选

1.1.1 数据收集与分析 利用基因表达谱在线分析平台GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)分析C14ORF169在人31种肿瘤组织样本及其相应正常组织中的差异表达。利用Oncomine数据库(https://www.oncomine.org)筛选出C14ORF169在结直肠腺瘤、结直肠癌组织及相应正常组织中的表达数据，数据筛选条件：“Gene: C14ORF169”；“Analysis Type: Cancer vs. Normal Analysis”；“Cancer Type： Colorectal cancer”；“Data Type: mRNA”。

1.1.2 从GEO数据库选择数据 从美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载基因表达谱结直肠癌样本数据集GSE12945和GSE17536。收集GEO数据集中具有完整临床病理学参数和生存资料的病例。采用X-Tile软件[17]确定C14ORF169 mRNA表达量的最佳截断值，据此将数据进行二分类，低于该值为低表达组，高于则为高表达组。

1.2 细胞株、质粒载体及主要试剂

结肠癌RKO和HCT116细胞株、Lenti-CAS9-puro质粒、人肾上皮293T细胞、慢病毒表达载体GV371、GV513(BamHⅠ/NheⅠ酶切)、慢病毒包装辅助质粒、慢病毒包装试剂盒、大肠埃希菌、TOP 10感受态均购自上海吉凯基因化学技术有限公司。T7 DNA 连接酶、BbsⅠ、琼脂糖凝胶购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、无内毒素小提中量试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；兔抗C14ORF169抗体(美国Abcam公司)；小鼠抗人GAPDH抗体(美国Santa Cruz公司)；引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。

1.3 慢病毒构建与包装

针对目的基因C14ORF169序列，设计小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)引物序列：GCCAGGACCGACCCGCTGTG，插入慢病毒质粒载体Lenti-sgRNA-EGFP，获得敲除质粒Lenti-C14ORF169-sgRNA-EGFP。从GV513载体获得C14ORF169表达片段并插入慢病毒载体，获得过表达质粒Lenti-C14ORF169-gcGFP。用空载对照质粒Lentil-CON-244-EGFP、敲除质粒Lenti-C14ORF169-sgRNA-EGFP、空载对照质粒Lentil-CON-335-gcGFP、过表达质粒Lenti-C14ORF169-gcGFP分别转染293T细胞，按慢病毒包装试剂盒说明书进行病毒包装，48 h后收集上清液过滤，荧光法测定病毒滴度后-80 ℃保存。

1.4 慢病毒感染RKO、HCT116细胞及稳定敲除株与过表达株的筛选

将RKO细胞株、HCT116细胞株于5% CO2、37 ℃培养，取对数生长期细胞，以5 × 104个/孔接种于6孔板。加入Lenti-CAS9-puro慢病毒，感染72 h；加入嘌呤霉素筛选3 d至细胞状态稳定。然后以同样的方法在RKO细胞中感染Lenti-C14ORF169-sgRNA-EGFP慢病毒作为RKO-KO组(敲减C14ORF169)，感染对照质粒Lentil-CON-244-EGFP作为RKO-NC组；在HCT116细胞中感染Lenti-C14ORF169-gcGFP慢病毒作为HCT116-OE组(C14ORF169过表达组)，感染对照质粒Lentil-CON-335-gcGFP作为HCT116-NC组。收集细胞进行后续实验。

1.5 免疫印迹法检测细胞中C14ORF169蛋白表达

取“1.4”中HCT116-OE、HCT116-NC、RKO-KO、RKO-NC细胞样品，PBS洗涤2次；加入预冷RIPA裂解液冰上裂解15 min；4 ℃ 12 000×g离心15 min；取上清液，BCA法测定蛋白浓度。在蛋白样品中加入6×上样缓冲液混匀，100 ℃水浴10 min；取40 μg总蛋白行10%SDS-PAGE分离；4 ℃ 300 mA恒流电转150 min，将蛋白转移到PVDF膜；用含5%脱脂牛奶的TBST溶液室温封闭1 h；分别加入抗C14ORF169抗体与抗GAPDH抗体(1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜4次，每次8 min；二抗室温孵育1.5 h(1 ∶7 500)；TBST洗膜4次，每次8 min；采用ECL增强化学发光法结合显色仪进行蛋白检测及发光，将曝光得到的目的条带用Image J软件进行灰度分析，得到的数值用GraphPad Prism 9作图。

1.6 CCK-8法检测细胞药物敏感性

将筛选后的稳定株HCT116-OE、HCT116-NC、RKO-KO、RKO-NC分别接种于96孔板中(5 000细胞/孔)，分别给予不同浓度梯度(0，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，160.0 μg/mL)的5-氟尿嘧啶(5-FU)，于5% CO2、37 ℃分别孵育48、72 h；加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育4 h；用酶标仪于490 nm处测其光密度(D)值。根据不同浓度梯度下各组细胞的活性用GraphPad Prism 9绘制拟合曲线，计算5-FU半抑制浓度(IC50)。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 C14ORF169 mRNA在多种人体肿瘤组织及对应正常组织中的表达

基于GEPIA平台分析TCGA数据库中有关C14ORF169mRNA在人31种肿瘤组织样本及其相应正常组织中的差异表达，结果显示，C14ORF169mRNA在结直肠腺癌(Colon Adenocarcinoma, COAD/Rectum Adenocarcinoma, READ)、皮肤黑色素瘤(SKCM)、乳腺癌(BRCA)等大部分癌症组织中呈高表达(图1)。

ACC: 肾上腺皮质癌；BLCA：膀胱上皮癌；BRCA:乳腺癌；CESC：宫颈鳞状细胞癌；CHOL：胆管癌；COAD：结肠腺癌；DLBC：弥漫大B细胞淋巴瘤；ESCA: 食管癌；GBM: 多形性胶质母细胞瘤；HNSC:头颈鳞状细胞癌；KICH：肾嫌色细胞癌；KIRC：肾透明细胞癌；KIRP: 肾乳头状细胞癌；LAML: 急性髓系白血病；LGG:脑低级别神经胶质瘤；LIHC：肝细胞癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鳞状细胞癌；OV：卵巢浆液性囊腺癌；PAAD：胰腺癌；PCPG：嗜铬细胞瘤和副神经节瘤；PRAD：前列腺癌；READ: 直肠腺癌；SARC: 肉瘤；SKCM：皮肤黑色素瘤；STAD: 胃腺癌；TGCT：睾丸生殖细胞瘤；THCA：甲状腺癌；THYM：胸腺瘤；UCEC：子宫内膜癌；UCS：子宫癌肉瘤

2.2 C14ORF169 mRNA在不同结直肠癌基因芯片中的表达

Oncomine数据库分析结果显示，C14ORF169mRNA在结直肠腺瘤和结直肠癌组织中的表达水平均高于正常组织。4项有关C14ORF169mRNA在结直肠腺瘤组织与正常组织中的表达差异分析显示[18-19]，C14ORF169mRNA在结直肠腺瘤组织表达高于正常组织(P<0.001，图2A)。将5项关于C14ORF169mRNA在结直肠癌组织与正常组织中表达差异的分析进行Meta分析，结果亦显示，C14ORF169mRNA在结直肠癌组织中的表达显著高于正常组织(P=0.001，图2B)。

图2 不同结直肠肿瘤芯片C14ORF169 mRNA研究的Meta分析

2.3 C14ORF169 mRNA表达水平与结直肠癌患者预后的相关性

在GSE12945数据集中，C14ORF169mRNA表达的最佳截断值为10.75。将GSE12945数据集中62例结直肠癌患者按C14ORF169mRNA表达的最佳截断值分为高表达组和低表达组。其中，高表达组10例，低表达组52例。采用log-rank法进行生存分析结果显示，C14ORF169mRNA高表达患者总体生存时间和无病生存时间明显短于低表达患者(P<0.05)。见图3。在GSE17536数据集中，C14ORF169mRNA表达的最佳截断值为9.44。177例结直肠癌患者按最佳截断值分为高表达组和低表达组。其中，高表达组54例，低表达组123例。生存分析结果亦显示，C14ORF169mRNA高表达组总体生存时间和疾病特异性生存时间明显短于低表达组(P<0.05)。见图4。

图3 C14ORF169 mRNA表达与结直肠癌患者预后的关系(GSE12945数据集)

图4 C14ORF169 mRNA表达与结直肠癌患者预后的关系(GSE17536数据集)

2.4 C14ORF169 mRNA表达水平与临床病理参数的相关性

由表1可见，C14ORF169mRNA表达与结直肠癌AJCC分期密切相关，肿瘤组织C14ORF169mRNA表达越高，AJCC分期越晚(P<0.05)。而C14ORF169mRNA表达与年龄、性别、病理分级无明显相关性(P>0.05)。由此提示，C14ORF169mRNA高表达可能促进结直肠癌转移从而导致预后不良。

表1 C14ORF169 mRNA表达与临床病理因素的关系 例

2.5 C14ORF169蛋白在结肠癌细胞中的表达

由图5可见，与对照组RKO-NC细胞相比，RKO-KO细胞中C14ORF169蛋白表达显著降低(t=475.0，P<0.05)，说明RKO细胞C14ORF169敲减稳定株构建成功；与对照组HCT116-NC细胞相比，HCT116-OE组C14ORF169蛋白表达显著上调(t=286.3，P<0.05)，由此说明HCT116细胞C14ORF169过表达稳定株构建成功。

图5 免疫印迹法检测HCT116和RKO细胞系中C14ORF169蛋白表达

2.6 细胞药物敏感性

CCK-8结果显示，相较于RKO-NC组细胞，C14ORF169敲减后的RKO-KO组细胞对5-FU的敏感性明显增加，48 h和72 h的IC50值分别为0.739 μg/mL和0.343 μg/mL；而C14ORF169过表达的HCT116-OE组细胞，在48 h和72 h的IC50值分别为3.581 μg/mL和1.909 μg/mL，相较于HCT116-NC组细胞，其对5-FU敏感性明显降低(图6)。结果表明，C14ORF169高表达可降低结直肠癌细胞对5-FU敏感性，反之则增强。

图6 C14ORF169表达量不同的细胞系在不同时间点5-FU的IC50测定结果

3 讨论

本研究基于GEPIA平台分析TCGA数据库中有关C14ORF169mRNA在多种肿瘤组织样本及其相应正常组织中的表达水平，结果显示，C14ORF169mRNA在结直肠腺癌、皮肤黑色素瘤、乳腺癌等多种肿瘤组织中表达较正常组织明显上调。同时，利用Oncomine数据库分析发现C14ORF169mRNA在结直肠腺瘤和结直肠癌组织中的表达水平均高于正常组织，说明C14ORF169作为一种肿瘤分子标志物，在肿瘤细胞中发挥着重要作用。进一步分析GEO数据库中检索的GSE12945数据集和GSE17536数据集发现，C14ORF169mRNA高表达结直肠癌患者总生存时间与疾病特异性生存时间明显缩短(P<0.05)，并且C14ORF169mRNA高表达与结直肠癌AJCC分期明显相关(P<0.05)，说明C14ORF169mRNA高表达往往导致肿瘤进展迅速、预后较差，C14ORF169是结直肠癌的预后危险因子，可能是结直肠癌中一种新的生物标志物。

淋巴管血管侵犯是结直肠癌明显的预后不良因素[20]。小脉管受侵与淋巴结转移有关，而且是独立的预后不良因素，肠壁外大静脉受侵也是独立的预后不良因素，提示有肝转移风险。若不进行治疗，发生肝转移的结直肠癌患者的中位生存期仅仅只有6～9个月[21]。已有淋巴管血管侵犯的结直肠癌患者往往已处于AJCC分期晚期。本研究结果显示，C14ORF169高表达的结直肠癌患者多属于AJCC晚期。而已有研究表明，C14ORF169高表达与结直肠癌转移、淋巴管血管侵犯密切相关[16]。由此提示，C14ORF169可能通过促进结直肠肿瘤细胞侵袭、转移等恶性生物学行为而引起患者预后不良。

5-FU常用于结直肠癌化疗[22]，通常与奥沙利铂、亚叶酸钙联合用于晚期或者转移性结直肠癌的一线治疗，降低AJCCⅢ期患者的肿瘤复发率[20]，有效延长患者生存期，改善生活质量。而化疗耐药患者往往疗效不佳、预后差[23]，化疗耐药与结直肠癌患者的不良预后密切相关[24]。近年来，随着对肿瘤分子生物学的不断研究，对肿瘤中特定靶向分子的治疗已成为抗肿瘤药物的研发重心。本研究结果表明，在结肠癌细胞中敲减C14ORF169后，结肠癌细胞对5-FU敏感性增加，而高表达C14ORF169的结肠癌细胞则对5-FU表现出更强的耐药性。由此提示，C14ORF169可能通过增强结直肠癌细胞的化疗耐药性而导致患者预后不良。

综上所述，C14ORF169在结直肠癌中高表达，高表达C14ORF169的结直肠癌患者总体生存时间和疾病特异性生存时间明显缩短，预后不良。这与C14ORF169高表达的结直肠癌患者多属于AJCC晚期相关，也与C14ORF169高表达能增强结直肠癌细胞对5-FU的化疗耐药有关，但其具体作用机制还有待进一步研究和探讨。