大肠杆菌检验方法的探究与分析

刘庆红，杨铭

（重庆市江津区疾病预防控制中心，重庆）

0 引言

人类及其他恒温动物的粪便中含有致病菌，不过一般情况下由于数量比较少而在检测上存在一定的困难。大肠杆菌也就是大肠埃希菌，是人和温血动物肠道中检出率最高的一种菌种[1,2]，如果从食物或者药品中检验出大肠杆菌，则有可能意味着粪便对其造成了污染进而受到了致病菌的影响。故大肠杆菌常被看作是药品受到粪便污染的指南菌种。在大肠杆菌、痢疾杆菌引发的肠炎及菌痢等疾病的治疗中经常被使用的抗菌药物有呋喃哇酮片。这种抗菌药物具有较好的抗菌特性，但是在受到污染的呋喃哇酮片含有大肠杆菌的检验上存在一定的困难。用于检验大肠杆菌的方法有很多，但是适宜应用在呋喃哇酮片这类抗菌药物的大肠杆菌的检验中的方法比较少。下面采用四种检验方法对呋喃哇酮片中大肠杆菌进行检验，探究哪种方法更适宜应用在呋喃哇酮片的大肠杆菌的检验中。

1 资料和方法

1.1 基本资料

备有呋喃哇酮片、不同孔径的混合纤维素酯微孔滤膜、乳糖胆盐培养液、含伊红美蓝琼脂的大肠杆菌生化反应培养基以及大肠杆菌使用CMCC(B)44102。

1.2 方法

提取适量的呋喃哇酮片和大肠杆菌CMCC(B),制成研究所需要的供试液备用，供试液中含有大肠杆菌和呋喃哇酮成分。方法一：采用一次离心法，即采用转速3000r/ min对供试液进行0.5h 的离心操作,提取适量的上清液。在乳糖胆盐培养液中置入上清液，进行36℃±1℃、48h±2h的培养，对有无浑浊、产气情况出现进行严密的观察。在伊红美蓝琼脂培养基上接种上清液实施平板分离检验，完成36℃±1℃、18-24h 的培养后，对该培养基上是否长出菌落进行严密的观察。方法二：采用二次离心法，即采用转速3000r/min 对供试液进行0.5h 的离心操作,提取足够的上清液，以转速3000r/min 再次实施0.5h 的离心操作，提取适量的上清液。在乳糖胆盐培养液中置入上清液，进行36℃±1℃、48h±2h 的培养，对有无浑浊、产气情况出现进行严密的观察。在伊红美蓝琼脂培养基上接种适量的上清液实施平板分离检验，完成36℃±1℃、18-24h 的培养后，对该培养基上是否长出菌落进行严密的观察。方法三：采用离心-滤膜法，即采用转速3000r/ min 对供试液进行0.5h 的离心操作,提取上清液通过0.45μm 混合纤维素酯微孔滤膜实施过滤,在乳糖胆盐培养液中置入所得的溶液，进行36℃±1℃、48h±2h 的培养，对有无浑浊、产气情况出现进行严密的观察。在伊红美蓝琼脂培养基上接种适量的所得溶液实施平板分离检验，完成36℃±1℃、18-24h 的培养后，对该培养基上是否长出菌落进行严密的观察。方法四：采用离心-双重滤膜法，即采用转速3000r/min 对供试液进行0.5h 的离心操作,提取上清液分别通过3.0μm 和0.45μm 孔径的混合纤维素酯微孔滤膜实施过滤。在乳糖胆盐培养液中置入所得的溶液，进行36℃±1℃、48h±2h 的培养后，对有无浑浊、产气情况出现进行严密的观察。在伊红美蓝琼脂培养基上接种适量的所得溶液实施平板分离检验，完成36℃±1℃、18-24h 的培养后，对该培养基上是否长出菌落进行严密的观察。

1.3 观察指标

以大肠杆菌的检验结果作为观察指标。胆盐乳糖培养液试验中完成培养后发现浑浊(+)、产气情况(+)存在于液体中，则视为有大肠杆菌 (+/+)检出,反之视为无大肠杆菌检出 (+/-、-/+、-/-)。伊红美蓝琼脂培养基试验中完成18-24h 的培养后发现金属光泽的紫色菌落长在培养基上,则视为有大肠杆菌检出(+),反之视为无大肠杆菌检出(-)。

2 结果

一次离心法应用在大肠杆菌检验中的结果是乳糖胆盐培养液稍微呈现出浑浊状态，没有产生气体，伊红美蓝琼脂培养基没有长出菌落。二次离心法、离心-滤膜法应用在大肠杆菌检验中的结果是乳糖胆盐培养液呈现出澄清状态，没有产生气体,伊红美蓝琼脂培养基没有长出菌落、离心-双重滤膜法应用在大肠杆菌检验中的结果是乳糖胆盐培养液呈现出浑浊状态，产生气体,伊红美蓝琼脂培养基中有显著性的菌落长出。离心-双重滤膜法检出大肠杆菌，其他方法未检出大肠杆菌。见表1。

表1 四类检验大肠杆菌的方法对吠喃哇酮片大肠杆菌的检验结果的对比

3 讨论

大肠杆菌在人和温血动物的肠道中存在，且数量多，随着粪便排出体外，会对土壤、水源、食物、药品等造成污染[3,4]。基于大肠杆菌是否存在于药品中可以判定药品是否被粪便所污染，一旦从药品中检出大肠杆菌，就意味着该药品受到了粪便的污染，如果患者服用受到污染的饮品则有可能患上消化道传染病[5,6]。故被看作粪便污染指南菌种的就包括大肠杆菌，检验大肠杆菌成为口服药物常规检验项目之一[7,8]。为了探究哪种大肠杆菌检验方法适用在呋喃哇酮片这类本身具有抑菌特性的抗菌药物的大肠杆菌检验中，进行了四类检验方法的对比分析，结果发现一次离心法、二次离心法、离心-滤膜法的乳糖胆盐培养液试验结果和伊红美蓝琼脂培养基试验结果显示无大肠杆菌检出，虽然一次离心法的应用显示出乳糖胆盐培养液有些许的浑浊，但这并不能意味着检出大肠杆菌，这种浑浊情况的出现可能是因为离心不彻底。而离心-双重滤膜法应用在大肠杆菌检验中的结果是乳糖胆盐培养液呈现出浑浊状态，产生气体,伊红美蓝琼脂培养基中有显著性的菌落长出，视为检出大肠杆菌。这种检验方法之所以对大肠杆菌的灵敏度高是因为其不但经过了离心操作还经过了两次滤膜过滤,在一定降低了呋喃哇酮的药物浓度，使之低于有效抑菌浓度。

由上可见，不同于其他三种检验方法，离心-双重滤膜法应用在大肠杆菌检验中，其检出大肠杆菌的概率更高一些，且具有操作简便的优势，更适宜在呋喃哇酮这类抗菌药物大肠杆菌的检验中应用。