山药总黄酮的提取及抗氧化活性研究

刘文全，罗 怡，朱守虎，周瑾瑞，王俊豪，张 齐

（安徽科技学院食品工程学院，安徽凤阳 233100）

山药又称山芋、淮山、薯蓣，为多年生缠绕草本植物。山药的原产地是河南焦作，现已在湖南、湖北、山西、云南、河北、安徽、江苏等地广泛种植。作为清代贡品，具有很高的营养价值和药用价值，还具有抗氧化[1]、抗菌消炎[2]、抗肿瘤[3]、降血糖、降胆固醇等多种功能，属于药食同源食品。山药肉质中含有丰富的黄酮类化合物、淀粉、多糖、蛋白质、尿囊素、皂苷等多种生物活性物质[4]。黄酮类化合物是植物代谢过程中产生的低分子量的二次代谢产物，是以2-苯基氯酮为基础的化合物[5]。黄酮类化合物种类很多，多以游离态或与糖结合成苷的形式存在，具有显著的药理和生理活性[6-7]，可以去除体内的氧自由基，是一种天然的强抗氧化剂。还有改善血液循环[8]、美容保健[9]等功效。近年来，以山药为原料生产加工的食品保健品，如山药核桃奶、山药饼、山药糕点等深受人们喜爱，具有较高的市场价值和实用价值。

超声波提取法[10]是采用超声波辅助溶剂进行提取，利用超声波具有的特性，通过增大介质分子的运动速度、增强介质的穿透力来破坏植物药材的细胞，从而提取出黄酮、皂苷、香豆素，木质素和生物碱等有效成分[11]。与传统有机溶剂萃取法[12]、碱溶酸沉法[13]、水浸提法[14]、酶水解法[15]等方法相比，具有萃取时间短、萃取效率高、经济环保且不影响提取物活性等优点。在试验提取和工业生产过程中具有非常广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

材料：山药，购于当地市场。选择新鲜、无霉点、无腐烂的山药，清洗晾干，去皮后切成小块，于85℃下烘干后粉碎，过60目筛，制得山药粉。

试剂：芦丁标准品、亚硝酸钠、无水乙醇、无水甲醇、硝酸铝、氢氧化钠、抗坏血酸，均为AR；ABTS，DPPH，美国SIGMA-ALORICH提供。

1.2 试验方法

1.2.1 绘制芦丁标准曲线

精确称取10 mg标准芦丁样品，用75%乙醇配制0.2 mg/mL常规标准溶液。取芦丁标准溶液0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL于6个25.0 mL容量瓶中，再加入5%亚硝酸钠1.0 mL，摇至混合均匀，于室温下静置6 min；加入10%硝酸铝1×10-3L，摇至混合均匀，室温下静置6 min；向系统中加入4%的氢氧化钠溶液10.0×10-3L，用75%乙醇定容至容量瓶刻度线，摇至混合均匀后静置15 min。同时，以75%乙醇为空白对照组，用紫外分光光度计测定波长510 nm处的吸收度。以芦丁的质量浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，确定回归方程Y=11.682X+0.012 4，R2=0.989 5。

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

式中：Y总——山药总黄酮的提取率，%；

V总——提取液的总体积，mL；

m——称取的山药粉的质量，mg；

C——样品中山药黄酮的质量浓度，mg/mL。

1.2.3 单因素试验

采用单因素试验研究乙醇体积分数、料液比、超声时间和超声温度对总黄酮提取率的影响。①乙醇体积分数：称取1 g山粉末5份，分别加入45%，55%，65%，75%，85%乙醇（体积分数，下同）20 mL，50℃提取2 h，以转速8 000 r/min离心10 min，取上清液。②料液比：称取1 g山药粉5份，加入85%乙醇，按1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶

1.2.2 山药中总黄酮的测定

称取1.0 g山药粉，在超声波处理机中加入一定体积分数的乙醇和一定的料液比，按照一定的提取时间和温度进行超声波辅助提取。于转速8 000 r/min离心10 min，收集上清液，测定体积。以乙醇为空白对照，于波长510 nm处测定吸收度，按照标准曲线计算芦丁当量，计算上清液中总黄酮含量。黄酮类化合物（Y）的提取公式如下：mL，下同）加入物料中，于60℃下提取2 h。③超声时间：称取1 g山药粉5份，加入20 mL 65%乙醇，60℃下分别提取0.5，1.0，1.5，2.5，2.5 h。④超声温度：称取1 g山药粉5份，加入20 mL 85%乙醇，在40，50，60，70，80℃提取2 h。以乙醇为空白对照，在波长510 nm处测定芦丁的体积和吸光度。根据芦丁标准曲线计算芦丁当量，并计算上清液中黄酮类化合物的含量。

1.2.4 正交试验设计

在单因素试验优化结果的基础上，建立了四因素三水平的正交试验。采用L（934）正交试验优化了山药总黄酮的提取工艺。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.2.5 山药总黄酮的抗氧化活性

（1） 山药黄酮提取液的制备。山药干粉150 g，乙醇体积分数75%，料液比1∶15，70℃下超声提取2 h。过滤去除杂质，减压浓缩提取物，用蒸馏水反复蒸发，直到没有酒精味。冷冻后，提取物备用。干燥后的样品用75%乙醇配制成0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL山药黄酮溶液。

（2）DPPH自由基清除能力测定。取2.0 mL不同质量浓度山药黄酮提取物，加入100μmol/L DPPH-甲醇溶液2.5×10-3L，摇至混合均匀，于暗处静置30 min，以双蒸馏水为参照，在波长517 nm处测定各质量浓度山药黄酮的吸光度A1；用去离子水代替萃取物，在相同条件下测定吸光度A0；其他条件不变，用蒸馏水代替DPPH的条件下测定吸光度A2。阳性对照组是相同质量浓度的抗坏血酸。

清除率（I%）的计算公式为：

（3）ABTS自由基清除能力测定。取0.2×10-3L不同质量浓度的山药黄酮提取物，相应加入7 mmol/L ABTS 4×10-3L，充分混匀，在室温下反应约6 min。用双蒸馏水测量吸光度A1作为734 nm的参考。在其他条件不变的情况下，用去离子水代替样品测定吸光度A0。在其他条件不变的情况下，用蒸馏水代替ABTS测定吸光度A2。以相同质量浓度的抗坏血酸作为阳性对照。

清除率（I%）的计算公式为：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对山药总黄酮提取率的影响

乙醇体积分数对提取率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对提取率的影响

由图2可知，提取率整体趋势表现为先上升再下降，当乙醇体积分数为45%~75%时，总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增加而增加，当达到最大提取率3.84%时，乙醇体积分数为75%，然后随着乙醇体积分数的增加而降低。造成该现象的原因可能是醇溶性杂质的存在，在低体积分数乙醇条件下杂质溶解较小，影响也较小，而在高体积分数乙醇条件下杂质溶解相对较多，从而降低了黄酮类化合物的提取率。

2.1.2 料液比对山药总黄酮提取率的影响

料液比对提取率的影响见图3。

图3 料液比对提取率的影响

由图3可知，提取率整体趋势为先上升再下降，料液比为1∶10~1∶20，总黄酮提取率随料液比的增加而增加，当料液比为1∶20时，提取率达到最大值3.15%，之后随着料液比的增加而减少。其原因可能是随着萃取剂质量的不断增加，黄酮类化合物从山药中的溶出速率加快，黄酮提取率提高；但是，过多的提取液会导致黄酮饱和，污染溶液，增加后续成本，因此1∶20为最佳料液比。

2.1.3 超声时间对山药总黄酮提取率的影响超声时间对提取率的影响见图4。

图4 超声时间对提取率的影响

由图4可知，提取率整体趋势表现为先上升后下降，超声时间为1~2 h时，总黄酮提取率随着超声波时间的增加而增加；在超声时间2 h时，最大提取率为3.42%，之后随着超声时间的增加而减少。造成该现象的原因可能是超声提取时间较短时，残留在山药中的黄酮类化合物过多，没有及时溶出，导致总黄酮提取率较低；当溶解时间过长时，溶解到乙醇中的黄酮类化合物在加热条件下空间结构发生改变，有效成分失活，导致总黄酮提取率降低。

2.1.4 超声温度对山药总黄酮提取率的影响结果

超声温度对提取率的影响见图5。

图5 超声温度对提取率的影响

由图5可知，提取率整体趋势为先上升再下降，当超声温度为40~70℃时，山药中总黄酮提取率随超声波温度的升高而增加；当达到最大提取率3.72%时，超声温度为70℃，然后随着超声温度的升高而降低。造成该现象的原因是当温度升高时，分子运动变得更加剧烈，黄酮类化合物溶出速率加快，提取率增加；当温度过高时，黄酮类化合物空间结构发生改变，有效成分失活，降低了黄酮类化合物的提取率。

2.2 正交试验结果

正交试验结果见表2。

由表2可知，各因素对山药总黄酮提取率影响的大小顺序为乙醇体积分数>超声时间>料液比>超声温度，最佳试验组合为A3B1C3D2。

表2 正交试验结果

2.3 山药总黄酮抗氧化活性试验结果

2.3.1 山药总黄酮对DPPH自由基清除率的影响

DPPH自由基有单电子，自由基清除剂能使单电子配对，从而使溶液褪色，并可用比色法进行测量。以维C和山药总黄酮为研究对象，比较DPPH自由基的清除效果。

山药总黄酮对DPPH自由基清除率的影响见图6。

图6 山药总黄酮对DPPH自由基清除率的影响

由图6可知，当山药总黄酮质量浓度为0.5~3 mg/mL时，DPPH自由基清除率与山药总黄酮质量浓度呈正相关。当质量浓度上升至3 mg/mL时，山药总黄酮对DPPH自由基的清除率达到90.01%，说明山药总黄酮对DPPH自由基有着较强的清除能力，但总体清除能力不如维C。

2.3.2 山药总黄酮对ABTS自由基清除率的影响

ABTS自由基清除能力也是反映抗氧化活性高低的有效方法，比较山药总黄酮和维C对ABTS自由基的清除效果。

山药总黄酮对ABTS自由基清除率的影响见图7。

图7 山药总黄酮对ABTS自由基清除率的影响

由图7可知，当山药总黄酮的质量浓度为0.5~3.0 mg/mL时，随着山药总黄酮质量浓度升高，ABTS自由基的清除率也随之增加。当山药总黄酮质量浓度达到3 mg/mL时，ABTS自由基清除率为97.87%。在此条件下，山药总黄酮对ABTS自由基的清除能力与维C相当。

3 结论

通过单因素试验和正交试验，确定了最佳工艺参数为乙醇体积分数75%，料液比1∶15，超声时间2 h，超声温度70℃，在此条件下山药总黄酮提取率为3.96%。通过山药总黄酮与维C的清除自由基能力进行对比，说明其对DPPH自由基和ABTS自由基都有较强的清除能力。黄酮类化合物能有效清除体内氧自由基，延缓细胞衰老，具有抗癌活性。因此，山药产品的开发和功能活性的研究具有很高的社会效益和经济效益。