粪便脱落细胞BMP3与BCAT1基因甲基化检测对结肠癌及癌前病变筛查的价值

李红海，张晓钿，房一鸣，吴俊梅

结肠癌作为结肠黏膜上皮恶性肿瘤，侵袭性强、预后差，发现时大多已至晚期，及早发现可及早治疗，对于提高生存率及改善预后具有重要意义[1]。结肠癌目前的主要检测方法为肠镜检测，但为侵入性检测，创伤大，且可能造成一些并发症[2]，对患者造成一定的伤害。若能寻找到一种依从性高、诊断价值高且经济的非创伤性筛查手段，则可提高结肠癌甚至癌前病变检出率，对于疾病防治有重要意义。粪便样本取样简单、无创、有较好的操作性和重复性，且粪便中含有脱落和游离的癌细胞DNA，有望成为结肠癌筛查方法[3]。DNA异常甲基化是肿瘤中常见的表观遗传学改变，其中骨形态发生蛋白3(bone morphogenetic protein 3，BMP3)基因常发生高频甲基化，且已成为肿瘤标志物用于结肠癌筛选[4]。甲基化通过多种酶实现，支链氨基酸氨基转移酶1(branched-chain amino acid transferase-1，BCAT1)作为启动氨基酸代谢的关键酶，在结肠癌诊断中亦有一定价值[5]。但单个基因诊断价值有限，目前尚未发现BMP3、BCAT1及二者联合检测诊断结肠癌相关研究，为提高结肠癌及癌前病变的检出率，本研究检测粪便脱落细胞BMP3、BCAT1甲基化情况，为临床上结肠癌及癌前病变预测提供一定试验依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2020年2—12月海南医学院第一附属医院胃肠肿瘤外科患者94例粪便样本，患者均经结肠镜检查或术后病理切片确诊，粪便样本在肠镜检查前或手术前收集，置于-80℃冰箱保存。其中结肠癌患者43例(结肠癌组)、结肠腺瘤患者19例(结肠腺瘤组)、单纯痔疮患者32例(对照组)。结肠癌组男21例，女22例，年龄45～70(53.78±4.65)岁；心率68～81(76.33±3.17)次/min；呼吸频率16～20(18.49±1.20)次/min；结肠腺瘤组男11例，女8例，年龄46～71(54.06±5.81)岁；心率66～80(76.31±3.91)次/min；呼吸频率15～21(18.43±1.24)次/min。对照组男17例，女15例，年龄46～70(53.19±4.49)岁；心率67～83(76.49±3.47)次/min，呼吸频率17～22(18.38±1.18)次/min。3组性别、年龄、心率、呼吸频率比较差异无统计学意义(χ2/P=0.453/0.798，F/P=0.227/0.797、0.025/0.975、0.078/0.925)。本研究经医院伦理协会审核并通过(审批号：HYLL-2019-190)，符合2013年修订的《赫尔辛基宣言》要求。患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：无家族遗传史患者。(2)排除标准：①伴有其他部位恶性肿瘤者；②样本采集前进行手术或放、化疗患者；③临床资料不完整者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 临床/病理特征：收集结肠癌患者的临床/病理特征，包括性别、年龄，临床分期、肿瘤最大径、肿瘤体积、分化程度、淋巴结转移、浸润程度情况等。

1.3.2 BMP3、BCAT1基因甲基化检测：自-80℃冰箱中取出粪便，随机编号，每个样本称量200 mg提取脱落细胞基因组DNA，严格按照磁珠法粪便脱落细胞基因组DNA提取试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，货号 WH0114-YNH)说明书进行。甲基化特异性PCR(MSP)检测BMP3、BCAT1甲基化，PCR引物由宝日医生物技术(北京)有限公司合成。首先进行PCR扩增，反应条件：95℃ 10 min；95℃ 30 s、61℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环。经琼脂糖凝胶电泳，若扩增出大小为142 bp的片段，则DNA提取成功。采用亚硫酸氢盐转化试剂盒(德国Qiagen公司)修饰DNA，用MSP技术检测检测DNA甲基化情况，BMP3甲基化上游引物：5’-GTTTGGAGTTTAATTTTCGGTTTC-3’，下游引物：5’-ATAACTTCGATCTCTCTCCCTACG-3’(扩增长度179 bp，退火温度54℃)；BMP3非甲基化上游引物：5’-GGTTTGGAGTTTAATTTTTGGTTTT-3’，下游引物：5’-AACTTAATCTCTCTCCCTACACC-3’(扩增长度178 bp，退火温度54℃，位于第3外显子区)。BCAT1甲基化上游引物：5’-GGTCCCATATTCAACATCTGC-3’，下游引物：5’-CACCTTTCCAGGCTCTTACA-3’(扩增长度197 bp，退火温度58℃)；BCAT1非甲基化上游引物：5’-TATTTGACAAAGAAGAGCTC-3’，下游引物：5’-ACTTGAAAAATCCGGTCCCA-3’(扩增长度196 bp，退火温度60℃，位于第4、5外显子区)。经琼脂糖凝胶电泳，甲基化判定标准：出现甲基化条带即为甲基化，仅出现非甲基化条带即为非甲基化。二者联合检测结果阳性判定标准：只要一个基因甲基化阳性即判定该样本阳性。

2 结 果

2.1 3组患者粪便脱落细胞BMP3、BCAT1基因甲基化阳性率比较 粪便脱落细胞BMP3、BCAT1单基因及二者联合基因甲基化阳性率比较，结肠癌组>结肠腺瘤组>对照组(P均<0.01)，见表1。BMP3、BCAT1基因甲基化典型琼脂糖凝胶电泳图，见图1。

表1 3组患者粪便脱落细胞BMP3、BCAT1单基因及二者联合基因甲基化阳性率比较 [例(%)]

注：S.样品；M.甲基化；U.非甲基化；Positive.阳性对照；Negative.阴性对照；BMP3与BCAT1中S1～S3样品随机选取图1 3组患者粪便脱落细胞BMP3、BCAT1甲基化状态

2.2 结肠癌患者粪便脱落细胞BMP3与BCAT1联合基因甲基化在不同临床病理特征中比较 粪便脱落细胞BMP3与BCAT1联合基因甲基化与非甲基化结肠癌患者淋巴结转移情况、浸润程度比较差异无统计学意义(P>0.05)，而甲基化患者肿瘤最大径、肿瘤体积大于非甲基化患者(P<0.01)，分化程度越低、临床分期越高基因甲基化阳性率越高，并高于非甲基化患者(P<0.05)，见表2。

表2 结肠癌患者粪便脱落细胞BMP3与BCAT1联合基因甲基化阳性在不同临床病理特征中比较 [例(%)]

2.3 粪便脱落细胞BMP3、BCAT1单基因及二者联合基因甲基化对结肠腺瘤的诊断价值 ROC曲线结果显示，BMP3基因甲基化(AUC 0.579，95%CI0.433～0.716)、BCAT1基因甲基化(AUC 0.521，95%CI0.377～0.663)、二者联合基因甲基化(AUC 0.574，95%CI0.428～0.711)的AUC比较，差异无统计学意义(Z=0.052，P=0.959)。

2.4 粪便脱落细胞BMP3、BCAT1单基因及二者联合基因甲基化对结肠癌的诊断价值 ROC曲线结果显示，BMP3基因甲基化(AUC 0.701，95%CI0.585～0.802)、BCAT1基因甲基化(AUC 0.744，95%CI0.630～0.838)、二者联合基因甲基化(AUC 0.852，95%CI0.752～0.924)的AUC比较，BMP3与BCAT1联合基因甲基化的AUC最高(Z=3.598，P=0.000)，见表3。

表3 粪便脱落细胞BMP3、BCAT1单基因及二者联合基因甲基化阳性对结肠肿瘤的诊断价值比较

3 讨 论

结肠癌发病率及病死率在恶性肿瘤中均排名第三位，在过去10年里，尽管对其诊断和治疗取得较大进步，但结肠癌患者5年生存率仍仅为50%～65%[6-7]。结肠癌的发病率高，且预后不良，是世界卫生组织公布的公共卫生问题[8]，目前亟需解决。寻找能够及早诊断疾病的基因并予对应治疗对于改善预后具有较高价值。本研究中以94例患者粪便样本为研究对象，探讨单纯痔疮、结肠腺瘤、结肠癌患者粪便脱落细胞中BMP3、BCAT1基因甲基化情况，为临床上早期发现疾病提供一定参考依据。基因甲基化是在不改变DNA序列前提下，引起染色体构象、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质的相互作用方式发生改变，从而控制基因表达，改变表观遗传现象[9]。已有研究表明，基因甲基化有望成为早期诊断多种恶性肿瘤的生物学标志物，包括食管癌、肺腺癌以及结肠癌等[10-12]。

BMP3属转化生长因子β家族一员，可诱导细胞分化，促进骨、软骨发育[13]；在肿瘤中参与肿瘤形成过程，能够影响淋巴结转移、肿瘤恶性程度和预后状况[14]。在本研究中发现，BMP3甲基化在结肠癌粪便脱落细胞中呈高表达状态，且对结肠癌有一定诊断价值，已发现BMP3在结肠癌中起抑癌作用，抑癌基因失活主要机制是启动区甲基化，BMP3的高甲基化对BMP3的表达具有抑制作用，可造成基因功能失活，导致肿瘤的形成，对于筛查结肠癌具有较大潜力[15-17]。BMP3甲基化升高可能抑制BMP3的表达，从而使BMP3的抑癌作用降低，间接促进癌症的发生。BCAT1又名ECA39基因，是催化支链氨基酸代谢的一种关键酶，可催化支链α-酮酸至支链L-氨基酸的可逆转反应，从而影响细胞生长，此外，BCAT1还参与细胞周期调控、细胞增殖、凋亡、分化过程[18-20]；在本研究中尚未发现单纯痔疮患者中BCAT1甲基化情况，在结肠腺瘤、结肠癌中发现BCAT1甲基化，且对结肠癌有一定诊断价值。已发现BCAT1甲基化在结直肠癌中与癌症复发状况关系密切，已成为特定的生物标志物[21]。提示BCAT1作为结肠癌新晋肿瘤标志物，若检测出现甲基化则患者患结肠腺瘤、结肠癌的几率增加。

进一步研究发现，BMP3、BCAT1二者联合基因甲基化对结肠癌有较高的诊断价值。基因甲基化在多数情况下可以调控遗传信息的表达，影响转录因子与其DNA靶位点的结合，改变靶基因的表达，是肿瘤发生的驱动因素[22-24]。分析结肠癌患者BMP3、BCAT1二者联合基因甲基化与临床病理资料关系发现，结肠癌患者粪便脱落细胞BMP3与BCAT1联合基因甲基化患者肿瘤最大径、肿瘤体积大于非甲基化患者，分化程度越低、临床分期越高甲基化几率越高，提示BMP3、BCAT1甲基化情况越明显，肿瘤最大径越大、肿瘤体积越大、分化程度越低、临床分期越高，可能促使肿瘤进一步恶化，疾病越严重。

综上所述，结肠癌中BMP3、BCAT1甲基化程度升高，对结肠癌有较高的诊断价值，且与临床病理资料关系密切，在临床上有一定应用价值。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

李红海：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；张晓钿：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；房一鸣：课题设计，实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；吴俊梅：进行统计学分析