葡醛内酯对异烟肼和利福平所致肝损伤小鼠肝组织自噬水平的影响*

刘 冠，马丽华，党裔武，刘丽敏，周 铭△

（1.湖北省武汉市肺科医院，武汉 430030；2.广西医科大学，南宁 530021）

结核病是严重威胁人类健康的重大公共卫生问题，在全球范围内广泛流行[1]。在我国患病率约为67/10万人次，且呈逐年上升趋势[2]。异烟肼和利福平是临床上一线抗结核药物[3]，但异烟肼的肝毒性会诱发肝酶过高，异烟肼和利福平联用会加重肝细胞的损伤[4]，可能迫使患者反复停药，导致耐药的发生，增加结核病治疗的难度[5]。因此，保肝护肝是结核病治疗过程中的关键措施。葡醛内酯，口服吸收后分解为葡萄糖醛酸，具有保肝护肝的作用[6]。葡醛内酯常用于急慢性肝炎、肝硬化的辅助治疗，还用于食物或药物中毒的解救[7]。研究表明，葡醛内酯在临床上防治抗结核药物所致的肝损伤具有重要的作用，疗效显著[8]。但葡醛内酯防治药物性肝损伤的作用机制尚未完全明确。研究表明，自噬在肝组织细胞的保护机制中起着十分重要的作用，是一种自我保护机制，普遍存在于真核生物体内[9]。因此，本研究探讨葡醛内酯对异烟肼和利福平所致肝损伤小鼠肝组织自噬水平的影响，探究其对肝脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40 只雄性SPF 级C57B/6J 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司（动物合格证：SYXK（京）2018-0042），体重为20～25 g，饲养于本院动物实验中心，饲养室保持良好通风，饲养环境温度为（25±2）℃，湿度（50±10）%，12 h 循环光照。正常饲养1 周以适应环境，第2 周开始进行实验。

1.2 药品与主要试剂 葡醛内酯（北京太洋药业有限公司，国药准字H11020656，规格：100 mg×100片）；异烟肼片（苏州第五制药厂有限公司，国药准字H32022930，规格：0.1 g×100片）；利福平（郑州民众制药有限公司，国药准字H41021154，规格：0.15 g×100 粒）。4%多聚甲醛（上海碧云天生物技术有限公司，产品批号：P0099）；苏木精―伊红（HE）染色液（北京索莱宝科技有限公司，产品批号：G1120）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、脂多糖（LPS）试剂盒（上海合富医疗科技股份有限公司，产品批号分别为MAK084、MAK096、MAK132）；Trizol 试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司，产品批号：00642586）；实时荧光定量PCR（qPCR）检测试剂盒（成都福际生物技术有限公司，产品批号：RT-02131）。

1.3 动物模型的建立 按随机数字表法将小鼠随机分为空白组、模型组、葡醛内酯低剂量组和高剂量组，每组10 只。模型组、葡醛内酯低剂量和高剂量组小鼠灌胃均给予异烟肼和利福平各150 mg/kg，空白组灌胃给予等体积生理盐水，共造模14 d，2次/d，建立肝损伤小鼠模型[10]。

1.4 给药方法 肝损伤小鼠模型制备完成后，灌胃葡醛内酯治疗，连续10 d，2 次/d。葡醛内酯低剂量和高剂量组小鼠分别按100 mg/kg 和200 mg/kg 的剂量灌胃，空白组和模型组则给予50 mL/kg的生理盐水。

1.5 小鼠体重变化及肝脏脏器系数的比较 末次给药结束后，小鼠禁食不禁水12 h，称量体重，摘除眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，立即取出肝脏，用冷生理盐水漂洗去除血液并用滤纸吸干，称重。切取少量肝组织，固定于4%多聚甲醛溶液中，剩余肝脏组织冻存于-20 ℃冰箱。计算小鼠肝脏脏器系数。肝脏脏器系数=肝脏重量/小鼠体重×100%。

1.6 小鼠肝脏组织病理形态的观察 取出经4%多聚甲醛溶液浸泡48 h 的小鼠肝脏组织，经脱水、常规石蜡包埋，切成4 μm 的切片。然后依次脱蜡、水化，进行HE染色、脱水、二甲苯透明、干燥。中性树胶封片，用光学显微镜观察肝脏组织形态并拍摄照片。

1.7 小鼠血清中肝功能指标的检测 将采集的血液于4 ℃下1 500 rpm离心10 min获得血清，采用全自动生化分析仪测定各组小鼠血清中ALT、AST、LPS水平。

1.8 电镜下观察肝脏组织内自噬小体数量 取各组小鼠部分肝组织，经2.5%戊二醛溶液固定，硫酸缓冲液漂洗及经锇酸固定后，采用乙醇梯度洗脱，并用多孔橡胶对组织进行包埋，切片、染色后再电镜下观察，每张切片随机选取10个视野记录自噬小体数量，并计算平均值。

1.9 qPCR 检测小鼠肝组织的自噬水平 依据Trizol法提取各组样本的总RNA，RT-PCR扩增自噬相关基因（autophagy related gene，Atg）5、Atg7、Beclin-1、GAPDH，其中GAPDH 作为内参引物，引物序列见表1。反应条件：75 ℃预变性，2 min，进入以下循环，90 ℃变性，5 min；60 ℃退火，60 s；72 ℃延伸，30 s；共40 个循环。相对表达量用2-ΔΔCT表示。每个样本独立重复实验3次。自噬相关基因及内参引物序列如下：Atg5（上游：5’-GGTGTGACGTGTCGGAAGGA-3’，下游：5’-CCTGGTCTCGCTAGGATGAG-3’）；Atg7（上游：5’-CTTTCCGCGGCACCAGA-3’，下游：5’AACGAATCCTGCGTTCATGT-3’）；Beclin-1（上游：5’-ACTTCGCCTGTCAGTCATA-3’，下游：5’-GGTGAGGCAGGGTCCT-3’）；GAPDH（上游：5’-AGGCCTACCTCCCTCGAA AG-3’，下 游：5’-CAGACAGCCAGATAGACGGAC-3’）。

1.10 统计学方法 数据分析采用SPSS 19.0软件，作图工具采用Graphpad5.01，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以百分率（%）表示，多组间比较采用R×C 列表资料χ²检验，组间两两比较采用Bonferroni 法的χ²检验；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 葡醛内酯对小鼠体重变化及肝脏脏器系数的影响 4 组小鼠的初试体重比较，差异无统计学意义（均P＞0.05），与空白组相比，模型组小鼠的终试体重明显减少，肝脏脏器系数明显降低（P＜0.05），与模型组相比，葡醛内酯低、高剂量组小鼠的终试体重明显增加，肝脏脏器系数明显升高（均P＜0.05）。见图1。

图1 葡醛内酯对小鼠体重变化及肝脏脏器系数的影响

2.2 葡醛内酯对小鼠肝脏组织病理形态的影响 空白组小鼠肝小叶结构完整清晰，细胞大小均匀，边界清楚，肝细胞索排列整齐，结构清晰可辨；模型组小鼠肝细胞边界不清，发生广泛的脂肪样变性，肝小叶结构被破坏，肝细胞索排列紊乱，汇管区有炎性细胞浸润，部分细胞核溶解，可见少量肝细胞发生点状和灶状坏死；低、高剂量组小鼠细胞索排列较整齐，肝小叶结构基本完整，汇管区偶见炎性细胞浸润，肝细胞变性坏死程度较模型组明显减轻。见图2。

图2 小鼠肝脏组织病理HE染色（×200）

2.3 葡醛内酯对小鼠血清肝功能指标的影响与空白组相比，模型组小鼠血清ALT、AST、LPS 水平明显上升（均P＜0.05）；与模型组相比，葡醛内酯低、高剂量组小鼠血清ALT、AST、LPS 水平明显下降（均P＜0.05），图3。

图3 葡醛内酯对小鼠血清肝功能指标的影响

2.4 葡醛内酯对小鼠肝组织自噬小体的影响 与空白组相比，模型组小鼠肝组织中自噬小体数量明显增多（P＜0.05），与模型组相比，葡醛内酯低、高剂量组小鼠肝组织中自噬小体数量明显减少（均P＜0.05）。见图4。

图4 电镜观察示各组小鼠肝脏细胞中自噬小体（白色箭头）的情况（×10 000）

2.5 葡醛内酯对小鼠肝脏自噬水平的影响 与空白组相比，模型组小鼠肝组织中Atg5、Atg7、Beclin-1 mRNA相对表达水平明显下降（均P＜0.05），与模型组相比，葡醛内酯低、高剂量组小鼠肝组织中Atg5、Atg7、Beclin-1 mRNA 表达水平明显上升（均P＜0.05）。见图5。

图5 葡醛内酯对小鼠肝脏自噬水平的影响

3 讨论

异烟肼和利福平是世界卫生组织（world health organization，WHO）推荐的临床一线抗结核用药[11]，但异烟肼代谢产生大量的自由基，使患者肝脏细胞内的氧化还原平衡被破坏，损伤肝细胞线粒体功能，导致药物性肝功能损伤[12]。异烟肼和利福平合用时，在肝脏中乙酰化的利福平为异烟肼提供大量的乙酰基，诱导肝药酶将乙酰异烟肼代谢为异烟肼，加重肝细胞的损伤，影响患者的治疗效果[13]。葡醛内酯口服吸收后分解为葡萄糖醛酸，是重要的结缔组织组成成分，与肝内含有羟基或羧基的毒物结合形成无毒物经肾脏排出体外，具有保肝和解毒的作用。研究表明，葡醛内酯在预防药物性肝损害方面有一定的作用，明显降低肺结核患者治疗期间的药物性肝损伤的发生率[14]。本研究成功构建了小鼠肝损伤模型，制备完成后给予葡醛内酯治疗，结果发现，与未获得治疗的小鼠相比，葡醛内酯治疗后的小鼠的饮食、毛色、活动、排泄物颜色、精神状态等情况明显好转。在观察期内，治疗后小鼠的肝脏脏器系数、血清肝功能指标ALT、AST、LPS 水平明显降低（均P＜0.05），表明葡醛内酯能够明显改善异烟肼和利福平所致肝损伤小鼠的肝损伤情况。Yu 等[15]探究葡醛内酯对赭曲霉素A 所致鸡肝细胞损伤的保护作用，结果显示，葡醛内酯治疗鸡肝细胞损伤的疗效显著，但其并未完全阐明其保护肝组织的作用机制。因此，本研究为进一步探讨葡醛内酯治疗异烟肼和利福平所致肝损伤的分子机制展开研究。

自噬是在进化上较为保守的自我保护机制，普遍发生于真核生物体内，自噬小体是整过过程的标志性物质[16]。自噬在肝脏组织细胞的保护机制中起着十分重要的作用，包括起始、成核、扩张和降解4个阶段[17]。细胞可通过自噬将胞内的受损细胞器及产生的异常大分子物质包裹并运输至溶酶体进行降解，保护肝脏细胞免受损害，还可维持营养物质代谢平衡及能量供应[18]。Atg5 和Atg7 参与了自噬的扩张过程，Beclin-1参与了自噬的成核过程[19]。杨丽等[20]探究利拉鲁肽对胰岛素抵抗小鼠肝脏组织自噬的影响，结果显示，与空白组相比，模型组小鼠肝组织中Atg7、Beclin-1 的mRNA 相对表达水平明显降低，与模型组相比，利拉鲁肽治疗组小鼠肝组织中Atg7、Beclin-1 的mRNA 相对表达水平明显升高。在本研究中，与空白组相比，模型组小鼠肝组织中自噬小体数量明显升高，Atg5、Atg7、Beclin-1的mRNA 相对表达水平明显降低（均P＜0.05），表明异烟肼和利福平所致肝损伤与肝组织自噬水平密切相关，葡醛内酯治疗后，小鼠肝组织中自噬小体数量明显降低，Atg5、Atg7、Beclin-1 的mRNA 相对表达水平明显上升（均P＜0.05），表明葡醛内酯可能是通过改善肝损伤小鼠的肝脏自噬水平起到保护肝脏的作用。Zhao 等[21]研究另一种护肝药物双环醇通过激活自噬降低小鼠急性肝损伤的结果与本研究相似。此外，值得注意的是本研究中葡醛内酯治疗小鼠肝组织中Atg5、Atg7、Beclin-1 的mRNA相对表达水平明显上升，但是自噬小体数量明显降低，这可能与选取的时间点有关[22]，这也是值得后续研究地方。

综上所述，葡醛内酯对异烟肼和利福平所致的肝损伤具有保护作用，其机制可能与改善肝组织的自噬水平有关。