刃天青显色法影响因素考察及相关改良方法

江 丹

(1.广州立白企业集团有限公司，广东广州，510370；2.广东省日用化学品可再生资源研究与应用企业重点实验室，广东广州，510170)

在新型冠状病毒引发的全球疫情形势下，家养宠物是否会感染病毒，是否会成为病毒的中间宿主，宠物的卫生安全引发了舆论和民众的广泛关注。世界卫生组织已经给出权威解答：目前没有证据显示犬猫等宠物会感染新型冠状病毒[1]。但是，做好宠物居住环境和宠物用品的清洁消毒工作仍然十分必要。在新冠疫情形势下，具有消毒除菌功效的宠物清洁护理产品是家养宠物消费者十分看重的价值点。然而，如何让家养宠物消费者在选购消毒除菌宠物清洁产品时切实地感受到除菌功效是业界的痛点。目前的现状是，消毒除菌宠物清洁产品提供专业检测机构的功效检测报告，家养宠物消费者很难获得直观的使用感受，特别是在“直播经济”浪潮下，如何在直播中直观展示宠物消毒产品的抗抑菌功效，成为了消费者和业界的迫切需要。因此，本研究旨在开发一种可视化的、定性的抗抑菌效果评价方法。

刃天青是一种传统的氧化还原染料，常用于微生物的生存和增殖情况评估。活细胞的代谢反应将蓝色、弱荧光的刃天青还原为粉红色、强荧光的试卤灵，说明细菌生长增殖。如果还原反应进一步发生，试卤灵将继续被还原成无色的、无荧光的二氢试卤灵[2]。刃天青被还原的化学变化及颜色变化见表1。因此，可通过检测刃天青的还原物质试卤灵和二氢试卤灵的荧光强度来反应细菌数量[3]。目前已有研究通过刃天青颜色变化进行细菌的半定量分析，如肉类变质检测[4]、口腔中变形链球菌的数量检测[5]等。

表1 刃天青的化学变化及其相关的颜色变化

实验考察了细菌培养方式、稀释液、细菌浓度等因素对刃天青显色法的影响，以期建立一种快速、可靠、可视化的评价产品抗菌除菌功效的方法，以适用于消毒除菌宠物清洁产品的直播功效展示。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1.1.1 实验菌种

金黄色葡萄球菌ATCC6538，购自广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.2 试剂与仪器

市售宠物消毒液，可用于宠物生活环境及用品的消毒除菌。

刃天青（购自阿拉丁）；氯化钠（购自天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；葡萄糖（购自广东光华科技股份有限公司，分析纯）；蛋白胨（购自OXOID）；营养琼脂培养基（购自广东环凯微生物科技公司）；D/E中和肉汤（购自DB公司）。

0.1 %刃天青溶液：取刃天青0.1 g，加蒸馏水100 mL，121℃灭菌20 min，避光保藏不超过1周。

生理盐水：取氯化钠8.5 g，加蒸馏水1000 mL，待完全溶解后，调pH至7.2～7.4，经121℃压力蒸汽灭菌20 min后备用。

PBS（0.03 mol/L磷酸盐缓冲液）：称取无水磷酸氢二钠2.83 g，磷酸二氢钾1.36 g，加蒸馏水1000 mL，待完全溶解后，调pH至7.2～7.4，经121℃压力蒸汽灭菌20 min后备用。

仪器均为微生物实验室常用仪器设备。

1.2 实验方法

1.2.1 刃天青显色反应的影响因素研究（

1）菌种培养方式

分别取36℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面菌种和营养琼脂平板菌种，用0.25%葡萄糖溶液洗涤菌种，用浊度仪调节菌悬液至浓度一致，用活菌计数法测定细菌浓度。各取稀释菌悬液5 mL至无菌试管中，再加入100 μL刃天青溶液，混合均匀后，将试管放置于36℃水浴锅中并立即计时，观察刃天青颜色变化。

（2）促进剂

取36℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌营养琼脂平板菌种，分别用无菌水、生理盐水、2%蛋白胨溶液和0.25%葡萄糖溶液洗涤菌种平板，5 mL/块平板，分别将菌悬液调整至浓度约3×108CFU/mL，同时按平板活菌计数法测定菌悬液浓度。

各取稀释菌悬液5 mL至无菌试管中，加入100 μL刃天青溶液，混合均匀后，将试管放置于36℃水浴锅中并立即计时，观察刃天青颜色变化。

（3）细菌浓度

取36℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌营养琼脂平板菌种，用0.25%葡萄糖溶液洗涤菌种平板，5 mL/块平板，并稀释菌悬液至107～109CFU/mL，同时按平板活菌计数法测定菌悬液浓度。

分别取稀释菌悬液5 mL至无菌试管中，各加入100 μL刃天青溶液，混合均匀后，将试管放置于36℃水浴锅中并立即计时，观察刃天青颜色变化。

1.2.2 改良的刃天青显色法和传统杀菌测试方法对比

（1）传统杀菌测试方法

用0.25%葡萄糖溶液将市售宠物消毒液稀释至1:150和1:400，参考QB/T 2738－2012《日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》开展抗菌测试。要求对照菌悬液浓度控制在2×108～9×108CFU/mL；中和剂选用D/E中和肉汤；作用时间为1 min和5 min。杀菌率＞90%表示有杀菌作用。

（2）改良的刃天青显色法

取3 6℃培养1 8～2 4 h的金黄色葡萄球菌营养琼脂平板菌种，0.2 5%葡萄糖溶液洗涤菌种平板，5 m L/块平板，将菌悬液调整至浓度2.0×108～9×108CFU/mL。

用稀释菌悬液将市售宠物消毒液稀释至1:150和1:400，取各稀释液5 mL至无菌试管中，再加入100 μL刃天青溶液，混合均匀后，将试管放置于36℃水浴锅中并立即计时，观察刃天青颜色变化。同时取5 mL菌液稀释液，按上述步骤操作，作为阳性对照，编号为C。

2 结果与讨论

2.1 刃天青显色法的影响因素

2.1.1 培养方式

细菌培养方式的影响见表2。从表2可以看出，在细菌浓度一致的情况下，平板培养的菌悬液使得刃天青颜色变化明显快于斜面菌种悬液。提高斜面菌种的浓度至平板菌种浓度的3倍，其颜色变化速度也较平板菌种慢5 min以上。想要快速改变刃天青颜色，平板培养菌种的方式优于斜面。

表2 细菌培养方式的影响

2.1.2 促进剂

促进剂的影响见表3。从表3可以看出，2%的蛋白胨和0.25%葡萄糖均可以加速刃天青颜色的变化，有助于在短时间内展示杀菌效果，0.25%葡萄糖的促进效果优于蛋白胨，以蛋白胨作为促进剂的刃天青溶液在10 min时可变为粉红色，葡萄糖则可在5 min内使得刃天青从蓝色变为粉红色。因此，选用0.25%葡萄糖作为刃天青显色实验的促进剂。

表3 促进剂的影响

2.1.3 细菌浓度

细菌浓度的影响见表4。从表4可以看出，随着细菌浓度的提高，刃天青颜色变化加快，细菌浓度接近时，刃天青颜色变化也较为接近。随着孵育时间的延长，刃天青也逐渐从蓝紫色向粉红色转变。在细菌浓度接近的情况下，实验结果重现性好。因此，观察刃天青的颜色可以半定量地评估金黄色葡萄球菌的浓度。

表4 细菌浓度的影响

当金黄色葡萄球菌的浓度为7.6×107CFU/mL时，需要9 min才能将刃天青转变为红色。为了在5 min内将刃天青的颜色转变为粉色或红色，金黄色葡萄球菌的浓度应在1.9×108CFU/mL以上；当浓度在9.1×108CFU/mL及以上时，红色/粉红色的试卤灵会在短时间内进一步还原为无色的二氢试卤灵。为保障刃天青颜色变化的时间波动较小，细菌浓度调控范围为2.0×108～9×108CFU/mL。

2.1.4 改良的刃天青显色法

综上，刃天青显色反应受到培养方式、促进剂、细菌浓度等多种因素影响。为使显色反应发生在5 min之内，改良的刃天青显色法需具备以下条件：菌种为营养琼脂平板新鲜培养金黄色葡萄球菌，菌悬液用量为5 mL，0.1%刃天青溶液用量为100 μL，0.25%葡萄糖溶液作为促进剂，菌悬液稀释液浓度为2.0×108～9×108CFU/mL。

2.2 改良刃天青显色法和传统杀菌方法对比

2.2.1 传统杀菌测试方法

为匹配刃天青颜色变化所需的细菌浓度，杀菌测试中初始加入细菌浓度也需达到108CFU/mL。杀菌作用时间为1 min时，宠物消毒液1:150稀释液和1:400稀释液均无杀菌作用，作用时间延长至5 min时，1:150稀释液有杀菌作用（见表5）。

表5 传统杀菌测试结果

2.2.2 改良刃天青显色方法的测试结果

从图1可以看出，稀释150倍的宠物消毒液，孵育5 min颜色没有变化，孵育18 h后，颜色略有变化，刃天青呈现蓝紫色；而稀释400倍的宠物消毒液，孵育4 min后，刃天青的颜色已经从蓝色变为紫红色，到第5 min时呈明显的粉红色。而阳性对照从4 min到5 min时，已经从粉红色转变为接近无色。从孵育5 min至18 h，稀释400倍的宠物消毒液和阳性对照颜色均没有明显变化。说明孵育5 min足以展现宠物消毒液的杀菌效果。

图1 刃天青显色法的测试结果

因此，稀释150倍的宠物消毒液具有杀菌作用，稀释400倍的宠物消毒液无杀菌作用。这与表4测试结果一致。由此说明，刃天青颜色变化法可用于宠物消毒液杀菌效果演示。改良的显色反应的结果和传统杀菌测试方法的结果一致。上述显色反应耗时较短，在5 min之内。而且结果可靠，适合用于即时杀菌效果评估。可以应用于消毒除菌产品的直播功效展示。

3 结论

通过对刃天青颜色变化影响因素的研究，发现金黄色葡萄球菌作为测试菌种时，菌种培养方式、促进剂及菌悬液的浓度均对刃天青显色反应有明显的影响。改良的刃天青显色法包含以下的条件：选择用营养琼脂平板培养菌种，稀释液为0.25%葡萄糖溶液，控制细菌浓度在2.0×108～9×108CFU/mL，该法可在5 min内定性评价宠物消毒液的杀菌效果。