基于网络药理学及系统生物信息学探讨治疗重症哮喘的潜在机制∗

包婷婷 姚晓彬 张忠德△

（1.广州医科大学附属中医医院，广东 广州 510000；2.广东省中医院，广东 广州 510145）

2018年发布的《全球哮喘报告》提示，全球已有超过3亿哮喘患者，其中重症哮喘是哮喘患者死亡的主要原因之一［1］。重症哮喘引起呼吸道气道黏液分泌增多，引发严重的气道阻塞，危及患者生命，WHO将重症哮喘定义为哮喘症状严重，常出现急性加重，且处于药物难以控制的状态［2-3］。糖皮质激素是治疗哮喘的首选用药，由于重症哮喘对糖皮质激素的敏感性显著下降，甚至出现耐药现象，需要加大激素的治疗剂量，但超过激素推荐使用剂量后并未获得更为显著的治疗效果，白内障、青光眼、骨量减少、肾上腺抑制等不良反应明显增加，因此亟须加强对重症哮喘的研究，以获取治疗重症哮喘的潜在靶点［2-3］。

网络药理学和系统生物信息学建立在人类疾病基因网络及蛋白质-蛋白质相互作用网络基础上，有助于挖掘治疗疾病的潜在靶点，已被用于中药药效物质研究和靶点研发。本研究基于网络药理学和系统生物信息学的理念，拟构“重症哮喘-靶点-通路”的调控网络，诠释治疗重症哮喘的潜在机制，为治疗重症哮喘寻找潜在靶点提供依据。

1 方 法

1.1 获取与重症哮喘的相关靶点 NCBI GENE数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）整合了来自广泛物种的基因信息，收录的基因信息包括基因术语、参考序列（RefSeqs）、图谱、途径、变异、表型以及与全球基因组，表型和基因座特异性资源的链接。NCBI GENE数据库广泛用于检索基因序列并用于检索与疾病相关的靶基因，将“severe asthma”输入检索框，限定物种设定为“Homo Species”。将靶基因列表输入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化，构建“重症哮喘-靶点”网络图。

1.2 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 为了深入研究重症哮喘靶点蛋白间的相互关联分析，将重症哮喘的相关靶点导入STRING 11.0数据库（https：//string-db.org/）进行PPI分析，综合分数（com⁃bined score）>0.4为筛查标准，限定物种设定为“Homo Species”［5］。将“SVG”文件从 STRING 11.0 数据库导出，并导入Cytoscape 3.7.2软件构建PPI网络图，节点的大小反应自由度（degree）大小，节点越大代表degree越大，使用Cytoscape3.7.2软件进行网络拓扑分析，将degree>2倍中位值的节点作为核心基因［6］。UniProt（http：//www.uniprot.org/）是一个最全面且功能齐全的蛋白质注释数据库，该数据库可集中收集蛋白质资源，将核心基因输入UniProt，并将该物种选为“Homo Species”，通过检索获得核心基因的详细信息。

1.3 获取PPI网络的重要模块 为了进一步获得PPI网络中重要的网络模块，并确认PPI网络的重要模块是否包括degree大于2倍中位值的核心基因，使用Cytoscape3.7.2的插件MCODE进行分析，筛选标准如下：degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，K-score=2，Max deapth=100，P<0.05被认为具有统计学意义。

1.4 基因本体论（GO）分析 GO分析是一种用于注释基因和基因产物常用的方法，以及用于鉴定高通量基因组或转录组数据的特征生物学属性。为进一步解析上述筛选出的靶基因的生物功能分类，将筛选得到的靶点导入DAVID v6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）并限定物种为人（Homo sapiens），进行GO功能分析。GO富集分析由生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3个部分组成，P<0.05被认为具有统计学意义，并根据条目P值进行可视化生成柱状图［6］。

1.5 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路注释分析 KEGG是从基因组角度理解生物功能的生物信息学资源，用于从基因组和分子水平信息中了解生物系统的高级功能和效用。KEGG是一种多物种，综合资源，由基因组学，化学和网络信息组成，交叉引用众多外部数据库来表示细胞功能。为了说明上述筛选出的靶基因涉及的通路机制，进一步使用DAVID v6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）对靶点行 KEGG通路分析，参数设置为“Homo sapiens”，限定只展示P<0.05的KEGG结果，并根据P值与基因富集数目进行可视化生成气泡图，进一步使用Cytoscape3.7.2软件构建“重症哮喘-靶点-通路”网络［7］。

2 结果

2.1 重症哮喘-靶点相互作用网络 重症哮喘-靶点网络共包括81个节点，其中包括1个疾病节点、80个靶基因节点，并含有80条互相作用的边，其中红色代表重症哮喘节点，绿色代表靶基因，靶基因包括肿瘤坏死因子（TNF）、转化生长因子B1（TGFB1）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17A（IL-17A）、基质金属蛋白酶 9（MMP9）、脂联素（ADIPOQ）、C 反应蛋白（CRP）、HLADRB1、核因子-κB1（NF-κB1）、ADRB2、白细胞介素-8（IL-8）等。每条边则表示重症哮喘与靶点之间相互作用的关系，见图1。

图1 重症哮喘-靶点网络图

2.2 PPI网络的构建及其核心靶点的筛选 为了进一步研究重症哮喘-靶点蛋白间的相互关联，本研究将筛选到的80个靶点基因导入STRING数据库获取蛋白相互作用关系网络图，PPI网络共涉及74个节点，492条边（图2）。在PPI网络中，靶点的连线越多则degree值越大，degree值越大则表明该节点在网络中处于重点位置并具有核心的作用。图2中节点越大代表degree越大，将degree>2倍中位值的节点作为核心基因，图2中绿色的节点degree>2倍中位值，蓝色的节点degree<2倍中位值，核心基因包括 TNF、IL-8、IL-10、IL-4、IL-13、IFNG、MMP9、IL-17A、CRP、JAK2、FOXP3、LEP、NF-κB1、IL-33，核心基因详细信息见表1。

图2 重症哮喘-靶点的PPI网络图

表1 治疗重症哮喘潜在核心靶点的基因信息

2.3 PPI网络核心模块的筛选 为了得出PPI网络核心模块，并确认PPI网络的重要模块是否包括degree大于2倍中位值的核心基因，使用Cytoscape3.7.3软件的插件MCODE分析了显著性较强的模块，模块里面呈现27个靶蛋白互作关系，包括PPI网络所获核心基因的其中 13个，包括 TNF、IL-8、IL-10、IL-4、IL-13、IFNG、MMP9、IL-17A、CRP、JAK2、FOXP3、LEP和 IL-33，这进一步确定了核心基因的重要性，见图3。

图3 重症哮喘-靶点核心互作模块

2.4 重症哮喘-靶点的GO分析 按照显著性程度排列部分展示重症哮喘-靶点涉及的生物过程，GO分析提示重症哮喘-靶点的BP显著富集在炎症反应，免疫反应，调控γ干扰素产生，调控蛋白激酶B信号转导，调节RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录，调节巨噬细胞的活化，调节T细胞增殖，调节细胞对脂多糖的反应，调节Stat3蛋白酪氨的酸磷酸化，调控脂肪细胞分化等。MF主要富集在细胞因子活性，几丁质酶活性，白介素1受体活性，细胞因子受体活性，几丁质结合，生长因子活性，蛋白质结合，G蛋白α亚基结合，水解酶活性，水解O-糖基化合物Ⅲ型转化生长因子β受体结合等。CC主要富集在细胞外空间，细胞外区域，质膜的外侧，质膜的组成部分，受体复合体，质膜，细胞表面，溶酶体，蛋白质细胞外基质，膜的组成部分，分泌颗粒，核染色质，细胞质等，见图4。

图4 重症哮喘-基因的生物学过程

2.5 重症哮喘-靶点的生物学通路与“重症哮喘-靶点-通路”网络构建 按照显著性程度排列部分展示，KEGG结果提示重症哮喘-靶点的信号通路主要富集在细胞因子与细胞因子受体的相互作用，Jak-STAT信号通路，脂肪细胞因子信号通路，MAPK信号通路，军团菌病，Toll样受体信号通路，哮喘，甲型流感，沙门氏菌感染，TGF-β信号通路，NF-κB信号通路，T细胞受体信号通路，RIG-I样受体信号通路，HIF-1信号通路，见图5。其次使用Cytoscape3.7.2软件构建“重症哮喘-靶点-通路”网络图，使重症哮喘-靶点-通路关系进一步清晰化，见图6。

图5 重症哮喘-基因的生物学通路

图6 重症哮喘-靶点-通路网络图

3 讨 论

流行病学研究表明，高达5%～10%的哮喘患者为重症哮喘，重症哮喘是呼吸系统疾病中常见的急危重症，具有较高的死亡率。重症哮喘隶属于哮喘分型中疾病严重程度最高的一类，重症哮喘发病急速、病情发展难以控制，极易诱发呼吸衰竭进而危害患者的生命，具有较高的致残率与致死率［8］。因此亟须分析及探索治疗重症哮喘的潜在靶点，为研究重症哮喘的发病机制及潜在的治疗药物提供新的思考方向。

NCBI GENE数据库收录了来自广泛物种的基因信息，本研究通过NCBI GENE数据库搜索与重症哮喘相关的基因共有80个，为了进一步挖掘治疗重症哮喘的潜在靶基因，本研究通过PPI网络设置degree>2倍中位数的参数，并使用MCODE分析出重要模块，双重确认所获取核心基因的可靠性，共获取14个核心基因，包括TNF、IL-8、IL-10、IL-4、IL-13、IFNG、MMP9、IL-17A、CRP、JAK2、FOXP3、LEP、NK-κB1和 IL-33。为了进一步分析80个潜在治疗靶点所涉及的生物过程，本研究进行了GO与KEGG分析，GO结果提示靶基因的生物过程多集中于炎症过程与免疫反应两大类别，这提示调节免疫过程与炎性反应是治疗重症哮喘的两大靶标。其次KEGG结果富集于与炎症、免疫和缺氧调控相关的Toll样受体信号通路，NF-κB信号通路，T细胞受体信号通路，RIG-I样受体信号通路和HIF-1信号通路，与气道重塑相关的TGF-β信号通路，与调节类固醇皮质激素敏感性相关的Jak-STAT信号通路和MAPK信号通路。

与轻中度哮喘不同，重度哮喘对类固醇皮质激素疗法的治疗反应较差，重症哮喘的动物模型具有以嗜中性粒细胞为主引发气道炎症的特点，且非来源于Th2细胞因子水平明显升高，包括IL-8、IL-17A，同时HDAC2活性显著降低，NK-κB1的活性则明显升高，HDAC2在介导皮质类固醇的抗炎作用方面具有重要的作用，HDAC2活性的降低与NFKB1活性的升高则会引发一系列炎性因子的转录，造成持续的炎症因子释放，过量IL-8的产生会导致重症哮喘对皮质类固醇的敏感性进一步下降，且IL-8是中性粒细胞强大的趋化因子，从而使气道的中性粒细胞性炎症反应持续增强与气道高反应性持续升高，提示针对性调控NK-κB1的活性及调节炎性因子IL-8、IL-17A的释放是治疗重症哮喘的潜在重要途径［9］。研究表明，即使重症哮喘患者已接受类固醇皮质激素强化治疗，但支气管肺泡灌洗液仍检测出较高的IL-33水平，同时患者的痰液仍检测出高水平的IL-17A mRNA，这提示IL-33和IL-17A是重症哮喘的潜在生物标志物甚至治疗靶标［10-11］。临床研究表明重症哮喘以中性粒细胞型哮喘此表型为主，中性粒细胞表型的几个不同的过程被上调，包括黏蛋白和氧化应激反应，Toll样受体信号传导和NF-κB信号通路在重症哮喘中的蛋白质相互作用网络显著凸显，促进了重症哮喘的发病［12］。气道重塑是哮喘的主要特征，与轻中度哮喘相比，重度哮喘患者中呼出的MMP9浓度更高，特别是在中性粒细胞气道炎症患者中，研究建议将气道中MMP9的浓度作为监测哮喘气道重塑的标志物，MMP9可被视为哮喘中正在进行的气道重塑的量的替代物，呼出的MMP9测量值可能有助于监测正在进行的气道重塑，以识别哮喘的严重阶段［13］。重症哮喘的发病机制与无效的免疫调节反应有关，研究证实重症哮喘患者中CD4 FoxP3 T细胞的计数明显低于轻度至中度哮喘患者［14］。TNF会加重哮喘气道的炎症反应，与哮喘的严重程度相关，IL-10则是具有抑制炎性反应的因子，IL-4对于B淋巴细胞合成IgE至关重要，IL-4的独特功能是促进Th2细胞的分化，因此它在免疫反应的近端和关键部位起作用，从而使IL-4成为有潜力的免疫反应的靶标，高水平的IL-13与气道高反应性、黏液分泌过多和气道纤维化相关，而敲除IL-13后，抑制了气道高反应性的发展，IL-4和IL-13通过一个共享的表面受体IL-4Rα信号激活STAT-6、STATs和SOCS-1的内源性抑制剂是IL-4信号通路的有效抑制剂，可能是重症哮喘的新治疗靶标［15］。

研究证实MAPK信号通路的激活参与重症哮喘的发病，与轻度至中度哮喘相比，重症哮喘患者外周血中的MAPK磷酸化水平明显升高，MAPK磷酸化水平升高直接导致下游MSK1激酶的磷酸化水平升高，通过使用MAPK抑制剂可显著抑制MSK1磷酸化并改善重症哮喘的症状，同时CXCL8的表达水平亦显著降低，这说明抑制MAPK信号通路的激活是治疗重症哮喘的潜在重要靶标［16］。IFNG水平的升高会引起重症哮喘的皮质类固醇的敏感性下降，IFNG可激活JAK1和JAK2，导致Y701和S727残基上的STAT1磷酸化并增强STAT1的激活，激活的IFNG信号传导过程无法被地塞米松逆转，但JAK抑制剂或STAT1抑制剂则可抑制IFNG信号传导过程，同时研究发现LPS和IFNG诱导肺泡巨噬细胞（体外重症哮喘模型）过量产生的IL-6和TNF-α无法被地塞米松逆转，表明IFNG、JAK/STAT1参与了重症哮喘的发病［17］。TGF-β信号通路在重症哮喘的气道重塑中起关键作用，TGF-β水平高低程度与哮喘发病的严重程度呈现正相关，具有成为检测哮喘急性加重程度的生物标志物，研究证明TGF-β通过诱导支气管上皮细胞凋亡促进哮喘的发展［18］。哮喘的急性发作与病毒感染或者细菌感染密切相关，KEGG信号通路提示流感与军团菌感染是治疗重症哮喘的潜在靶点，说明预防病毒感染与细菌感染是预防哮喘急性与重症发作的重要途径［19］。最近研究表明缺氧会增强哮喘气道炎症和加重气道重塑，学者证实OVA+缺氧刺激导致支气管嗜中性粒细胞显著上升，同时HIF-1α和TGF-β1和气道重塑指数水平显著上升，提示缺氧状态下激活的HIF-1通路激发哮喘小鼠的气道中性粒细胞性炎症及引起气道重塑，并使肺功能急剧恶化，说明调控HIF-1通路以改善气道缺氧状态是治疗重症哮喘及控制哮喘急性加重的重要靶标［20］。

本研究的结果提示重症哮喘-靶点-通路与重症哮喘的发病关系密切，说明通过调节重症哮喘-靶点-通路，具有调控由这些靶基因引发的免疫过程和炎性反应所导致的皮质类固醇的敏感性下降、气道重塑、气道高反应性、气道黏液高分泌状态、气道阻塞和气道中性粒细胞性炎症反应的潜在作用。值得注意的是重症哮喘-靶基因与中性粒细胞性炎症密切相关，提示通过调控靶基因减轻气道的中性粒细胞性炎症是治疗重症哮喘的潜在重要靶标。

综上所述，重症哮喘是一种复杂的慢性气道疾病，本研究为将来研究重症哮喘分子靶标与通路提供了一系列潜在目标，揭示开发针对本研究所获得的多靶点、多通路功能的药物可能是今后治疗重症哮喘的重大方向，但是需要进一步的临床试验、体内与体外实验进行验证。