天香丹对急性心肌梗死大鼠IL-18表达及心肌超微结构的影响∗

赵明芬 孙龙飞 安冬青

（1.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830000）

天香丹是著名心血管专家安冬青教授运用中医通补开泄法治疗冠心病研制的已经上市的有效药物。天香丹主要由新疆地产药蔷薇红景天、丹参以及民族药物唇香草等组成，在临床中取得较好疗效。前期研究显示天香丹有减轻炎症反应、稳定动脉斑块、抗动脉粥样硬化的作用［1-2］。本课题在大量前期工作基础上，拟用结扎左前降支方法制备急性心肌梗死的大鼠为研究对象，实施天香丹大地、中、小剂量干预治疗。从炎性因子、内皮功能、心功能、心肌超微结构等为切入点研究以评估天香丹治疗急性心肌梗死的药用效果，进一步探索天香丹改善急性心肌梗死的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取7周龄左右的SPF级Wistar雄性大鼠54只，体质量（200±20）g，动物购自新疆医科大学动物中心，许可证号：SCXK（新）2018-0002，动物批号：SCIK（新）20190225。

1.2 试药与仪器 天香丹颗粒，购自新疆维吾尔自治区中医医院，药物批号：新药制字Z04000820。一氧化氮（NO）试剂盒（货号：A013-2。批号：20190522）购自南京建成生物工程研究所有限公司。白细胞介素-18（IL-18）试剂盒（货号：AE90232Ra。批号：201905），内皮素-1（ET-1）试剂盒（货号：AE90650Ra。批号：201905）均购自AMOKE。超声诊断仪：飞利浦公司HD11 XE。显微镜：Nikon E200。蛋白转膜仪：Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra system DHG型。酶标仪：Bio-Rad xMarkTM。

1.3 分组与造模 7周龄左右雄性Wistar大鼠54只，经适应性饲养后分为空白组（6只）、假手术组（6只）、模型组（6只）和低、中、高剂量组（各12只）。根据文献，于大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉，运用开胸方法结扎大鼠左冠状动脉前降支，造成急性心肌梗死模型［3-4］，术后连续5 d肌内注射青霉素钠2×100 000 U/d以防感染。假手术组不结扎前降支，其余操作相同；空白组不做处理。

1.4 给药方法 于造模后成功后24 h开始干预治疗。天香丹按每次剂量为高（10.2 g/kg）、中（3.4 g/kg）、低剂量（1.1 g/kg）［5］，每日2次，连续灌胃7 d。空白组、假手术组和模型组连同灌胃1 mL/100 g的0.9%氯化钠注射液。

1.5 心电图及心脑超声检查 1）心电图。将针电极刺入大鼠四肢皮下，分别记录术前、心梗术后、术后第7天肢体Ⅱ导联心电变化。2）心脏超声。于急性心肌梗死术后第7天大鼠称体质量后进行心脏超声检测左室射血分数（EF）、左室收缩端及左室舒张末期直径（LVDs、LVDd）、左室短轴缩短率（FS）、收缩期室间隔与舒张期室间隔厚度（IVSs、IVSd）、dP/dt max（mmHg/s），dP/dt min（mmHg/s）、左室舒张末期压力（LVEDP mmHg）。

1.6 标本采集与检测 1）ELISA检测IL-18以及ET、NO含量。记录完心电图及心超后经腹主动脉抽血2 mL，置于抗凝管内，4 ℃，3 000 r/min，离心10 min，取血清置于-20℃保存，采用ELISA检测血清中IL-18、ET、NO含量，按照试剂盒说明书进行操作。2）心肌超微结构观察。大鼠麻醉后开胸迅速摘取心脏，置冰上器皿中操作。生理盐水洗去血渍，滤纸吸干多余水分，心脏分为2份，靠心尖部分完整成圆或椭圆形，于乳头肌横切面切取心梗区、移行区、健存区等心肌组织，电子天平称重（精确到0.1 mg），10%中性甲醛溶液固定。将固定好的大鼠心肌组织进行梯度脱水，然后进行石蜡包埋，再切成5 μm厚的薄片，放在温水浴中进行匀称展片，固定于载玻片上，制成石蜡切片。将组织切片置于65℃恒温箱中烘烤1.5～2 h，经过脱蜡、水化、苏木素染色、盐酸酒精分化1～2 s、自来水中终止分化5 min，再进行脱水、伊红复染、透明以及中性树胶封片等操作，电镜下观察染色情况及组织轮廓、心肌超微结构。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。所有数据以（±s）表示。数据若符合正态分布，采用单因素方差分析方法统计：方差齐性，采用LSD方法进行多重比较；方差不齐，采用Tamhane方法进行多重比较，P<0.05表明有显著性差异；数据若不符合正态分布，先对数据进行对数转化，使数据正态化，再按照上述单因素方差分析方法对数据进行统计。

2 结果

2.1 各组急性心肌梗死模型大鼠心电图ST段情况比较 见表1。与术前相比，术后模型组ST段波幅、T波显著升高，表示造模大鼠急性心肌梗死模型成功；与术前相比，连续灌胃7 d后，天香丹低、高剂量组心电图ST升高显著降低（P<0.05），说明天香丹低、高剂量对心肌缺血有良好的改善作用。

表1 各组急性心肌梗死模型大鼠心电图ST段情况比较（±s）

表1 各组急性心肌梗死模型大鼠心电图ST段情况比较（±s）

注：与本组术前比较，△P<0.01；与术后比较，▲P<0.05；与假手术组比较，∗P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

时间术前术后术后7 d空白组0.056±0.014假手术组0.063±0.013 0.070±0.029 0.030±0.016△▲模型组0.084±0.007 0.249±0.072△*0.352±0.102△*天香丹低剂量组0.087±0.015 0.284±0.048△*0.156±0.024△▲*天香丹中剂量组0.079±0.035 0.291±0.106△*0.117±0.033*#天香丹高剂量组0.071±0.017 0.218±0.060△*0.049±0.049▲#

2.2 各组心肌梗死模型大鼠心脏超声指标比较 见表2。心脏超声检测结果显示，与空白组比较，LVEF、FS、LVDs、LVDd、IVSs、IVSd均无显著差异（P>0.05），与假手术组比较模型组LVEF、FS、LVDs、IVSs、IVSd变化显著（P<0.05），说明模型建立成功。与模型组比较，天香丹低剂量组IVSd显著低于模型组（P<0.05），与模型组比较，天香丹中剂量组各指标变化均无显著差异（P>0.05），与模型组比较，天香丹高剂量组LVEF、FS变化有显著差异（P<0.05）。

表2 各组心肌梗死模型大鼠心脏超声指标比较（±s）

表2 各组心肌梗死模型大鼠心脏超声指标比较（±s）

注：与空白组比较，◆P<0.05；与假手术组比较，▽P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；与天香丹低剂量组比较，△P<0.05；与天香丹中剂量组比较，▼P<0.05。下同。

组别空白组假手术组模型组天香丹低剂量组天香丹中剂量组天香丹高剂量组n 6 6 6 1 2 12 12 LVEF（%）35.790±4.876 35.522±5.313 16.456±4.029◆▽13.647±3.385◆▽18.308±3.430◆▽33.573±9.524▲△▼FS（%）73.148±5.964 72.727±7.148 41.349±8.534◆▽35.371±7.458◆▽45.234±6.915◆▽69.163±12.219▲△▼LVDs（mm）4.095±0.474 4.632±0.669 7.313±1.162◆▽8.254±0.987◆▽8.011±1.370◆▽4.940±1.234△▼LVDd（mm）6.365±0.323 7.167±0.656 8.742±1.209◆9.572±1.191◆9.764±1.308◆▽7.354±0.895▼IVSs（mm）1.810±0.298 1.986±0.392 1.060±0.138◆▽0.814±0.175◆▽1.029±0.273◆▽1.297±0.380▽IVSd（mm）1.362±0.189 1.330±0.157 1.017±0.109◆▽0.778±0.151◆▽▲0.944±0.180◆▽1.006±0.167◆▽△

2.3 各组心肌梗死模型大鼠心肌超微结构变化比较 空白组与假手术组心肌纤维排列整齐，未见明显病变；模型组较多心肌纤维断裂，大片溶解坏死伴玻变；心肌细胞空泡变性显著，并见较多核固缩及横纹消失；间质大量纤维组织增生，较多慢性炎细胞浸润，散在较多出血灶。与模型组比较：低剂量组与中剂量组心肌改善情况不明显；高剂量组心肌细胞空泡变性及坏死程度减轻，间质纤维组织增生明显减少，炎细胞浸润减轻。说明高剂量天香丹对缺血心肌超微结构有改善作用。见图1。

图1 各组心肌梗死模型大鼠心肌超微结构变化比较（HE染色，400倍）

2.4 各组心肌梗死模型大鼠血清IL-18、ET-1、NO含量比较 见表3。相对于模型组，天香丹高剂量组IL-18含量显著降低，NO含量显著升高（P<0.05）；低、中剂量组质量浓度与模型组无差异（P>0.05）；药物干预组随药物浓度的增加（P<0.05），NO含量逐渐升高，IL-18、ET-1含量逐渐降低（P<0.05）。

表3 各组心肌梗死模型大鼠血清IL-18、ET-1、NO含量比较（±s）

表3 各组心肌梗死模型大鼠血清IL-18、ET-1、NO含量比较（±s）

组别空白组假手术组模型组天香丹低剂量组天香丹中剂量组天香丹高剂量组n 6 6 61 2 12 12 IL-18（ng/L）5.517±0.200 5.534±0.264 8.257±0.495◆▽7.962±0.506◆▽7.469±0.855◆▽6.343±0.514▲△▼ET-1（ng/L）44.007±18.940 50.647±20.317 105.967±12.697◆▽82.458±15.120◆79.936±27.266◆76.858±13.716 NO（μmol/L）0.233±0.125 0.297±0.155 0.510±0.180 0.510±0.128 0.546±0.252 0.874±0.259◆▽▲

3 讨 论

天香丹组方中丹参性味苦，微寒，归心、肝经，具有活血化瘀、通经止痛作用。其含有丹参酮，有研究表明丹参酮ⅡA可有效抑制超敏C反应蛋白、白细胞介素-1β（IL-1β）以及P-选择素，显著减少细胞上清液中白细胞介素-6（IL-6）、IL-8，保护血管内皮细胞，减轻血管炎性损伤［6-9］。蔷薇红景天为新疆地产药物，性平和，味甘苦，归心、肺两经，具有益气活血功效，其所含红景天苷等物质，具有抗炎、降血脂、抗氧化、保护心脑血管以及抗细胞凋亡等功效，能够上调心肌组织的低氧诱导因子1α、1β的含量，促进大鼠心肌血管的新生，能够有效改善冠心病患者临床症状及异常心电图［10］。唇香草为新疆地产药物，又名新塔花、苏则，其性味辛性凉，具有芳香辟秽、理气化痰等作用；其挥发油中含量物质复杂，如薄荷烯酮、β-蒎烯等［11-12］，在心血管疾病应用中具有抗氧化、抗心肌缺血、舒张血管等作用，临床长期用于治疗冠心病等有确切疗效［13］。由蔷薇红景天、丹参、唇香草等组方的天香丹治疗冠心病具有益气活血、芳香行气、辟秽祛邪、宽胸开痹等通补开泄之功效。

冠心病发生的根本原因是冠状动脉粥样硬化，斑块形成或破裂，最终导致心肌缺血缺氧而出现胸闷、胸痛等症状。动脉粥样硬化形成是诸如遗传、生活方式、肥胖、脂质、血糖代谢紊乱、高血压、相关炎性因子等多因素参与。IL-18是一种重要的炎性细胞因子，其在促进动脉粥样斑块的炎症过程中有起到重要作用。IL-18刺激干扰素产生，损伤内皮细胞，导致基质金属蛋白酶活性增强，导致局部微循环血流淤滞，加快胶原蛋白物质降解速度，引发组织坏死，而造成器官功能进一步损伤［14］。本实验表明相对于模型组，天香丹高剂量组IL-18含量显著降低；低、中剂量组于模型组无差异；天香丹组随药物低、中剂量组质量浓度的增加，IL-18逐渐降低。结果说明天香丹能显著降低IL-18，减少炎性因子对心肌的损害是保护缺血心肌的作用机制之一。

急性心肌梗死时心肌缺血缺氧可导致心肌细胞损伤，其形态结构改变、功能下降和心肌能量代谢异常，早期病理变化可出现心肌细胞变性与心肌超微结构的改变。因此及早保护缺血的心肌细胞及其心肌超微结构尤为重要。NO是调节内皮细胞功能重要的细胞信使分子［15］，具有扩张血管、调节局部血流、抑制内皮细胞凋亡等作用，能够抑制心肌重构，是调节干细胞分化、增殖以及抗心肌纤维化因子［16］。ET是一种强效的缩血管物质，可引起内皮功能障碍和炎症，是促进平滑肌细胞增殖活性的多肽，当内皮受损时，ET释放，引起血管收缩甚至痉挛，导致心肌缺血［17］。另外有研究ET-1基因类型与心肌肥厚有关，在肥大的心肌中检测到ET-1的表达增高，证明其能诱导心肌细胞肥大［16］。因此心肌缺血缺氧时，降低ET-1，升高NO可保护缺血心肌与心肌超微结构，改善心功能。

本实验证实天香丹低、中、高剂量组均可显著减少心电图ST升高，说明天香丹对心肌缺血有良好的改善作用。本实验显微镜下观察，高剂量组间质纤维组织增生明显减少，心肌细胞空泡变性及坏死程度减轻，炎细胞浸润减轻，而低剂量组与中剂量组心肌改善情况不明显；说明高剂量天香丹对缺血心肌细胞及超微结构有保护作用，随着剂量增加作用更明显。从心脏超声结果分析，天香丹高剂量组干预后均显著升高模型大鼠射血分数；对心室结构及心功能有显著改善作用。本实验表明，相对于模型组，天香丹高剂量组干预后NO含量显著升高；低、中剂量组与模型组无差异；药物干预组随药物质量浓度的增加，NO含量逐渐升高，ET-1含量逐渐降低，说明天香丹能显著降低ET-1，升高NO是保护缺血心肌和超微结构的机制之一，随着剂量的增高，效果更明显。

本研究结果表明，天香丹可不同程度地减轻急性心肌梗死后心肌细胞与组织损伤，维持细胞正常形态，改善心肌超微结构与心功能，具有重要的保护作用。其可显著降低IL-18及ET-1，升高NO是其改善心肌缺血，保护血管内皮功能，阻止心肌损伤坏死，保护心肌超微结构与心功能的作用机制之一，表明其是治疗冠心病心肌缺血的有效药物。