基于网络药理学探讨参附黄方调治脓毒症的作用机制∗

张米镎 杨亮亮 郭玉红 徐霄龙 何莎莎 白云静 刘清泉 2，△

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；3.北京市中医研究所，北京 100010；4.中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室，北京 100010）

脓毒症是由宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍［1］，是感染、创伤、烧伤、休克等临床急危重症的常见并发症之一，具有患病率高、病死率高、治疗费用高的特点［2］，严重影响着人类的健康。尽管多年来国际上对脓毒症采用积极的“拯救”措施，但由于脓毒症的病理生理机制复杂，涉及炎症反应、免疫损害和凝血功能障碍等多系统的功能紊乱，并且随着人口老龄化、抗生素广泛使用及耐药菌增多等原因，该病已成为医学界面临的重大挑战。刘清泉教授结合中医理论和临床经验将脓毒症的基本病机总结为“正虚毒损，络脉闭阻”，提出“扶正解毒通络，分层扭转”的治法［3］，并选用红参、附子、大黄组成参附黄方用于脓毒症的治疗，在临床和动物实验中均获得了确切的疗效［4-6］，但其药效物质基础和作用机制尚不明确。

中药网络药理学是以系统生物学为基础，整合了数据库检索、靶点功能分析、靶点通路富集分析等多种研究手段，揭示“药物-成分-靶点-疾病”之间复杂的关系网络，从整体角度展现中药成分靶点间的相互作用关系，从多方位理解疾病的分子基础［7-8］。故本研究基于网络药理学对参附黄方调治脓毒症的作用机制和靶点进行预测和分析，为该方的深入研究提供依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 药物有效成分及靶点筛选

通过TCMSP数据库（https：//www.tcmspw.com）［9］获得每味中药的化学成分，根据ADME初步进行潜在活性成分及相关靶点的筛选，属性值设定为口服利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18，并结合已发表文献予以补充。运用Perl语言对靶点名称在Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）进行基因名称转换。

1.2 疾病靶点筛选

应用GeneCard数据库（https：//www.genecards.org/），OMIM数据库（http：//omim.org/）以及TTD数据库（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd）挖掘脓毒症相关靶点；检索Drugbank数据库（https：//www.drugbank.ca）寻找治疗脓毒症的西药作用靶点予以补充。以“sepsis”为检索词进行检索，将上述检索结果进行合并后删去重复值获取脓毒症靶点。

1.3 疾病靶点与药物靶点交集

利用R语言对参附黄相关靶点和脓毒症靶点取交集，并绘制韦恩图。

1.4 PPI网络的构建及核心靶点筛选

将交集靶点导入 STRING（https：//string-db.org/），将物种设为“Homo sapiens”，将蛋白相互关系的评分设为0.4，其余均为默认设置，得到参附黄作用于脓毒症的PPI网络。进一步利用R语言统计PPI网络中的核心靶点。

1.5 药物-成分-靶点-疾病网络图的构建

利用Perl语言，得到的药物有效成分及靶点信息关系，创建网络关系文件及交集靶点对应的有效成分列表。应用Cytoscape 3.7.2软件进行可视化。

1.6 GO分析和KEGG通路富集分析

将交集基因导入DAVID数据库（https：//david.ncif⁃crf.gov/），设定阈值P<0.05，选择GO下的生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）进行分析，选择Pathway分析中KEGG Pathway进行KEGG通路富集分析。应用微生信在线绘图平台（http：//www.bioinformat⁃ics.com.cn/）进行可视化。

2 结果

2.1 参附黄方有效成分及靶点获取

见表1。初步检索红参化学成分74种、附子化学成分65种、大黄化学成分92种，经ADME筛选后共获得红参4种、附子21种、大黄16种活性成分（表1）。红参成分作用靶点53个、附子成分作用靶点27个、大黄成分作用靶点95个，合并后删除重复值共得到靶点76个。

表1 参附黄方中主要活性成分基本信息

2.2 脓毒症相关靶点获取

从Genecards数据库获得脓毒症靶点2 316个。根据经验设定Score大于中位数的目标靶点为脓毒症的潜在靶点，则通过GeneCards所得脓毒症靶点Score最大值为31.51，最小值为0.19，中位数为2.54，故设定Score>2.54的靶点为脓毒症的潜在靶点。结合OMIM、TTD、Drugbank数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，最终得到1 285个靶点。

2.3 疾病靶点与药物靶点交集

见图1。利用R语言将筛选的药物有效成分靶点与疾病靶点取交集，得到共同靶点28个，并绘制韦恩图。

图1 药物成分-疾病靶点韦恩图

2.4 PPI网络的构建及核心靶点筛选

见图2，图3。通过STRING平台获得参附黄方调治脓毒症靶点的PPI网络（图2）。应用R语言统计各靶点连接节点的数目，通过柱状图展现靶点相互作用的紧密程度，进而可直观筛出参附黄方治疗脓毒症的核心靶点（图3）。

图2 参附黄方-脓毒症潜在靶点的PPI网络图

图3 各靶点连接节点的数目图

2.5 药物-成分-靶点-疾病网络图的构建

见表2。应用Perl语言将交集靶点对应的药物有效成分逐个对应，其中β-谷甾醇是红参和大黄的共有成分，分别给各成分按简称命名（表2）。应用Cyto⁃scape3.7.2软件构建药物-成分-靶点-疾病可视化网络图（图4）。

图4 药物-成分-靶点-疾病网络图

表2 交集靶点对应参附黄方主要活性成分列表

2.6 GO分析和KEGG通路富集分析

将28个共同靶点，通过DAVID数据库，进行GO分析和KEGG富集分析。

2.6.1 GO分析结果 见图5。GO分析得到271个条目（P<0.05），其中GO-BP条目180个，GO-CC条目14个，GO-MF条目25个。将各项均按P-value升序进行排序，选取排序居于前10位者进行可视化。

图5 GO分析柱状图

2.6.2 KEGG富集分析结果 见表3，图6。KEGG通路富集分析结果提示：28个交集靶点显著富集在54条信号通路上（P<0.05），提示参附黄通过作用多条通路来发挥调治脓毒症的作用。P-value按由小到大排列，选取排序居于前20位者进行可视化（表3）。

图6 KEGG通路富集分析气泡图

表3 参附黄方调治脓毒症KEGG富集通路及关联基因

3 讨论

脓毒症是重要的医疗卫生问题，每年影响着全世界数百万人，因此脓毒症的治疗受到临床医师的高度重视［10］。中药复方调治脓毒症的优势不可小觑，其调治机制具有靶点多位、层次丰富、安全性高等特点。然而，由于中药复方含有大量药物成分，包含了大量信息，很难阐明其作用机制。因此，基于网络药理学，本研究从有效成分、作用靶标、重要通路3方面探讨参附黄方治疗脓毒症的作用机制。

3.1 有效成分的药理作用

参附黄方可能作用于脓毒症的有效成分有β-谷甾醇、人参皂苷Rh2、芦荟大黄素、泽兰黄醇等。脓毒症是一种机制复杂的综合征，病程中涉及炎症、凝血、免疫等多方面紊乱，而上述化学成分具有抗炎、调节免疫、调节凝血功能等作用。β-谷甾醇在抗氧化、抗炎、免疫调节等方面具有良好的作用［11］。人参皂苷Rh2具有显著的免疫调节作用，既可调节免疫细胞功能及多种细胞因子分泌［12］，又能抑制内毒素诱导的炎症反应［13］。芦荟大黄素具有保护心血管、保肝、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节及泻下等作用［14］。另外，检索TCMSP数据库发现泽兰黄醇的作用靶点包括凝血因子Xa、凝血因子Ⅶ、凝血酶等，即反映该成分可能在复方中具有影响凝血功能的作用。

3.2 关键靶点的治疗意义

本研究结果表明，参附黄方调治脓毒症的关键靶点主要参与了炎症、免疫、凝血等过程。TNF是一种重要的细胞因子，可诱导细胞凋亡、炎症、免疫和凝血等多种细胞内信号通路。CASP3也参与细胞凋亡的信号传导［15］。PTGS2是非甾体消炎药的靶标，负责产生炎症性前列腺素的主要同工酶。IL-1β是有力的促炎细胞因子，诱导前列腺素合成，中性粒细胞活化，T细胞活化和细胞因子产生，B细胞活化和抗体产生；还能与IL-12协同诱导Th1细胞合成IFNG［16］。PPARG可抑制NF-κB介导的促炎反应［17］。IFNG除具有抗病毒活性外，还具有重要的免疫调节功能。NOS2基因编码一氧化氮合酶，可由脂多糖和某些细胞因子的组合诱导；参与炎症反应，可增强促炎介质如IL-6和IL-8的合成［18］。TGFB1可通过调节淋巴细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和粒细胞来控制炎症反应的发生和消退［19］。

3.3 重要通路的生物作用

参附黄方可能通过多条通路作用于脓毒症。细胞凋亡就具有积极意义，如肾脏细胞凋亡机制，特别是肾小管上皮细胞凋亡可能在脓毒症急性肾损伤中起关键作用［20］。另外TNF通路也很重要，研究发现严重腹腔感染早期应用参附黄方有助于下调肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的过量表达、防止肠屏障损伤、抑制机体过度的炎症反应、防止 MODS出现［6］。通过抑制 NF-κB/TNF-α信号通路的活化，减少肾脏促炎因子TNF-α、白细胞介素-1β（IL-1β）的表达，从而发挥保护脓毒症大鼠肾脏的作用［21］。可见，细胞凋亡、TNF通路可能是参附黄方调治脓毒症的关键通路。

本研究结果表明参附黄方中的同一成分可调控多个不同靶点，同一靶点参与不同的信号通路，从宏观上体现了参附黄方多组分、多靶点、多通路治疗脓毒症的特点，即说明我们在对网络中的单个或多个重要靶点进行调控时就可对整个网络产生调节作用，为临床运用参附黄方治疗脓毒症提供了科学依据，也为挖掘参附黄方的潜在作用机制提供了方向。本研究主要是以生物信息学与海量数据计算的结果为前期基础，后续将在此基础上进一步深入探究，并进行动物或细胞实验验证，以期明确参附黄方调治脓毒症的主要靶点和通路。