平喘颗粒对哮喘气道相关炎症因子及肺组织HMGB1、TLR4表达的影响∗

李 星 李竹英 王 珏△

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

支气管哮喘（简称哮喘）是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病。气道炎症在哮喘的形成和发病中都至关重要，是导致气道高反应及气道重塑的病理基础［1］。哮喘发病过程中炎症细胞的募集、炎症因子的分泌都受到多种因素的影响。有研究指出［2］，高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）和Toll样受体 4（TLR4）在气道炎症中发挥重要作用，其中HMGB1偏于哮喘气道及炎症维持方面，TLR4偏于炎症的免疫调节方面，为研究气道炎症提供新的方向。平喘颗粒是由黑龙江中医药大学附属第一医院呼吸科经过多年临床验证治疗哮喘的经验方化裁而来。前期研究发现，平喘颗粒可抑制上皮细胞转化、自噬及凋亡，调控气道平滑肌细胞增殖及凋亡，抑制血管生成等［3-7］，从而减轻哮喘气道重塑。本研究通过卵清蛋白（OVA）致敏和激发建立哮喘小鼠模型，观察小鼠肺组织中HMGB1、TRL4蛋白表达及相关气道炎症因子水平，以此探讨平喘颗粒对哮喘气道炎症的作用，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取40只清洁的健康雄性BALB/c小鼠，体质量（20±3）g，合格证号SCXK（黑）2015-003。小鼠饲养于黑龙江中医药大学实验室，温度21～24℃，相对湿度在43%～51%的环境下，适应性喂养1周。

1.2 试药与仪器

1）试剂。卵蛋白（美国Sigma公司，批号：20180511），氢氧化铝干粉（白银良友化学试剂有限公司，批号：20180921），吸入用布地奈德混悬液（澳大利亚Astia⁃zeneca PtyLtd，批号：H20140475），BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0012），HE染色试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20181103），抗HMGB1、TLR4抗体（美国Abcam公司，批号：ab79823、ab13556），小鼠白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：EK0394、EK0411、EK0527）。2）药物。平喘颗粒（淫羊藿200 g，炙麻黄100 g，太子参150 g，黄芪150 g，五味子150 g，款冬花150 g，地龙100 g，罂粟壳40 g，知母100 g）由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室提供，10 g/袋，批号：20180723。3）仪器。自制雾化箱（40 cm×35 cm×25 cm），超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备有限公司，型号402AI），组织包埋机（美国Thermo公司，型号TEC2800），石蜡切片机（德国Leica公司，型号RM2235），低电子显微镜（奥林巴斯株式会社，型号BX35），电泳仪（北京六一仪器厂，型号DYY-6C），电泳槽（北京六一仪器厂，型号DYCZ-20C），酶联免疫检测仪（美国伯腾仪器有限公司，型号ELX800）。

1.3 分组与造模

健康雄性BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组、平喘颗粒组、布地奈德组，每组10只。空白组给予单纯盐酸缓冲盐溶液250 μL及生理盐水代替雾化和激发。除空白组的其余3组于实验第1、7、14天给予的混合液250 μL［25 μg OVA和2.5 mg Al（OH）3］腹腔注射进行致敏，于第21天开始进行雾化激发，每天给予2%OVA溶液进行雾化，每次雾化30 min，连续激发7 d，造成哮喘模型。

1.4 干预方法

于致敏第1天开始对小鼠进行灌胃给药，空白组和模型组给予等体积的0.9%氯化钠注射液灌胃；布地奈德组给予0.5 mg/mL混悬液（吸入用布地奈德混悬液1 mg与0.9%氯化钠注射液2 mL），每次雾化30 min；平喘颗粒组给予平喘颗粒药液（31.2 g/kg）灌胃，给药时间同布地奈德组雾化时间。给药时间共2周，各组均于末次激发24 h后处死。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 小鼠肺组织病理染色及炎症评分 将取出的肺组织进行HE染色，进行脱水-透蜡-包埋-切片处理，后经蒸馏水清洗后分别置于苏木素水溶液和伊红染色液中进行染色，然后脱水，封片，于显微镜下观察病理染色情况。支气管周围及其周围炎症评分情况根据HE染色进行判断，标准如下［8-9］。0分：无炎症细胞。1分：少许炎症细胞。2分：较多分布不均匀的炎症细胞，或炎症细胞形成环状，局部炎症浸润。3分：大量分布均匀的炎症细胞，少见聚集成团，或炎症细胞形成环状，炎症范围小于1/3的肺横截面积。4分：大量炎症细胞聚集成团，或炎症细胞形成环状，炎症范围在1/3～2/3肺横截面积。

1.5.2 小鼠BALF中嗜酸性粒细胞（EOS）、中性粒细胞（NEU）计数及相关炎症因子水平的检测 将小鼠麻醉处死后，打开胸腔，结扎右肺主支气管。用0.9%氯化钠注射液0.5 mL刺入主支气管进行左肺支气管肺泡灌洗，重复3次，回收BALF。在4℃条件下1 500 r/min离心5 min得到上清液，-80℃条件下保存。用重悬液沉淀细胞，取细胞悬液制作图片并晾干，显微镜下行BALF中EOS及NEU的计数。按照ELISA试剂盒说明书操作，进行BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的检测。

1.5.3 小鼠肺组织HMGB1、TLR4蛋白检测 取小鼠右肺组织样本，加入细胞裂解液，离心后收集上清液，用BCA法测定蛋白浓度。按照比例配置凝胶，将蛋白按照顺序加入上样孔内，80 V电压电泳40 min，后调节120 V恒压2 h条件下将蛋白移至PVDF膜，脱脂牛奶封闭1 h，加入稀释后的一抗HMGB1、TLR4和β-actin单克隆抗体，4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，进行洗涤，ECL发光底物显影，用软件分析条带光密度值，以β-actin蛋白灰度值为内参，以目的条带的密度值与内参β-actin的密度值之比作为相对表达量。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组小鼠HE病理染色及炎症评分情况

见图1～图2，表1。镜下可见，空白组肺泡结构基本正常，间隔无水肿增厚，无明显炎症细胞浸润；模型组肺泡结构被破坏，可见大量炎性细胞浸润，间隔水肿增厚，支气管管壁明显变窄；平喘颗粒组及布地奈德组与模型组比较，支气管周围及血管外周炎症明显减少，支气管管腔无明显狭窄。炎症评分结果表明：与空白组比较，模型组气道炎症评分明显升高（P<0.01）；与模型组比较，平喘颗粒组和布地奈德组气道炎症评分明显降低（P<0.01）；平喘颗粒组和布地奈德组比较无显著性差异（P>0.05）。

图1 各组小鼠肺组织结构（HE染色，200倍）

图2 各组小鼠肺组织结构（HE染色，400倍）

表1 各组小鼠炎症评分情况

2.2 各组小鼠BALF中EOS及NEU计数比较

见表2。与空白组比较，模型组EOS及NEU计数明显升高（P<0.01）；与模型组比较，平喘颗粒组和布地奈德组可明显降低EOS及NEU计数（P<0.01）；平喘颗粒组和布地奈德组比较无显著性差异（P>0.05）。

表2 各组小鼠BALF中EOS及NEU计数比较（×105/mL，±s）

表2 各组小鼠BALF中EOS及NEU计数比较（×105/mL，±s）

组别空白组模型组平喘颗粒组布地奈德组n 10 10 10 10 EOS 0.29±0.12 3.86±0.82##1.24±0.24**1.18±0.33**NEU 0.18±0.06 2.57±0.86##0.73±0.13**0.69±0.15**

2.3 各组小鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平比较

见表3。与空白组比较，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，平喘颗粒组和布地奈德组IL-1β、IL-6、TNF-α明显降低（P<0.01）；平喘颗粒组和布地奈德组比较，平喘颗粒组IL-6明显低于布地奈德组（P<0.01），而两组的IL-1β、TNF-α比较无显著性差异（P>0.05）。

表3 各组小鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

表3 各组小鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

组别空白组模型组平喘颗粒组布地奈德组n 10 10 10 10 IL-1β 26.52±8.82 190.67±18.64##89.36±11.57##**90.96±7.42##**IL-6 39.85±4.28 143.52±9.68##63.32±5.43##**△△76.77±2.62##**TNF-α 48.98±6.11 224.14±13.55##86.13±12.64##**84.28±9.73##**

2.4 各组小鼠肺组织中HMGB1、TLR4蛋白表达比较

见图3，表4。与空白组比较，模型组HMGB1、TLR4的表达明显升高（P<0.01），与模型组比较，平喘颗粒组和布地奈德组HMGB1、TLR4的表达明显降低（P<0.01）；平喘颗粒组和布地奈德组比较无显著性差异（P>0.05）。

图3 各组小鼠肺组织中HMGB1、TLR4蛋白表达情况

表4 各组小鼠肺组织中HMGB1、TLR4蛋白表达比较（±s）

表4 各组小鼠肺组织中HMGB1、TLR4蛋白表达比较（±s）

组别空白组模型组平喘颗粒组布地奈德组n 10 10 10 10 HMGB1 0.346±0.075 1.075±0.091##0.546±0.033##**0.505±0.465##**TLR4 0.288±0.006 0.926±0.019##0.576±0.01##**0.615±0.012##**

3 讨 论

平喘颗粒经过多年的临床与实验研究已颇见成效，为本院呼吸科常用的平喘方。全方由淫羊藿、炙麻黄、太子参、黄芪、五味子、款冬花、地龙、罂粟壳、知母组成。其中淫羊藿温补肾阳、炙麻黄温补肺阳，二者合而为君，共奏温阳平喘之功。黄芪补肺脾之阳，太子参补脾肺之气，五味子敛肺补肾，款冬花润肺止咳，地龙清肺平喘，以上5味共为臣药。罂粟壳敛肺止咳，为方中之佐药。知母润肺止咳，引方中诸药归肺肾二经，诸药合用共奏温阳益气、化痰平喘之功。现代药理学研究发现，方中君药淫羊藿的有效成分淫羊藿苷能够降低脂多糖诱导的HMGB1高表达［10］，抑制TRL4及其下游核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的活化［11］，从而减轻炎症反应。君药麻黄水提物可降低哮喘小鼠支气管及其周围组织炎症，降低BALF中EOS及NEU计数，降低肺组织炎症因子及Eotaxin的表达，起到抗炎作用［12］。因此，本研究认为平喘颗粒可能通过降低HMGB1、TLR4的表达及相关炎症因子的水平，减轻哮喘小鼠的气道炎症，并通过实验进一步证实。

HMGB1为富含活性染色质的一种非组蛋白，存在于在细胞核内，在调控DNA复制、修复和转录方面发挥作用。当细胞受到炎症刺激时，核膜通透性增加，HMGB1分泌到细胞质中，然后由嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等主动分泌到胞外环境中［13-14］，与Toll样受体及晚期糖基化终产物受体结合传递细胞内信号［15］，发挥促炎作用。TLR4为Toll样受体中的一员，当病原体侵袭机体时，可诱导炎性反应并促进炎性细胞的转录、表达及释放［16］，其产生炎症反应主要是与介导NF-κB增加有关，进而导致下游炎症反应，TLR4/NF-κB被普遍认为是导致疾病炎症的重要通路［17-18］，在启动和调节炎症中发挥重要作用，从众多研究中可发现，HMGB1和TLR4参与了急性肺损伤、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、过敏性鼻炎等多种疾病炎症反应［19-21］，其中也包括哮喘。有研究报道，OVA诱导的哮喘模型小鼠TLR4及HMGB1表达量明显升高，同时会释放IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子［22-23］。HMGB1与TLR4结合后会诱导内皮细胞活化，募集炎症细胞，主要是EOS［24］。经过TLR4抑制剂或抗HMGB1抗体干预后，可降低哮喘小鼠炎性细胞数量、炎性细胞积聚及炎症因子的水平［25］，由此可知TLR4和HMGB1参与了哮喘气道炎症，可作为哮喘气道炎症的生物标志物。

在本实验中，我们通过OVA制备哮喘小鼠模型发现，模型组的哮喘小鼠HE染色及炎症评分改变明显，BALF中EOS计数、NEU计数、IL-1β、IL-6、TNF-α水平较空白组明显升高，肺组织中HMGB1、TLR4表达明显上升，应用平喘颗粒后可减轻炎症浸润、降低炎症评分，明显降低嗜酸性粒细胞和中性粒细胞计数及BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，肺组织中HMGB1、TLR4表达也明显下降，得出的结果与文献报道基本一致［26］。本实验提示平喘颗粒可有效减轻炎症细胞的浸润和相关炎症因子的水平，抑制HMGB1、TLR4蛋白表达，改善气道炎症，从而起到治疗哮喘的作用，在抑制气道炎症方面值得应用与推广。