一株溶磷促生菌的分离、鉴定及其对玉米幼苗生长的影响

张芬芬，周晓伦，贺洋洋

（甘 肃医学院临床医学系/基础医学院，甘肃 平凉 744000）

【研究意义】粮食生产对人类生存至关重要，玉米（Zea maysL.）是世界重要的粮食作物之一，广泛应用于工业、养殖业以及畜牧业中［1］。氮、磷参与植物光合作用、营养吸收、细胞分裂和生物氧化等重要代谢途径，是植物生长发育所必需的大量营养元素［2］。为了满足农作物生存、生产所需的氮、磷等营养元素，几乎所有的土壤都需要化肥来补充无机磷支持作物生产，但反复使用化肥会导致土壤结构恶化［3］，而且土壤中95%的磷的存在形式难以被植物吸收利用［4］。因此，分离和利用土壤溶磷微生物，促进植物吸收磷元素，应用微生物肥料替代部分化肥逐渐成为现代农业技术的研究热点。植物根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR）是指定殖于植物根际系统，并能促进植物生长和提高产量的一类细菌的总称［5］。PGPR 在促进作物固氮能力、改善土壤环境以及提高植物抗病抗逆能力等方面有重要研究意义［6］。【前人研究进展】有研究报道关于植物根际促生菌的固氮、溶磷、产氨作用，溶磷菌可以释放有机酸、螯合和离子交换使土壤中的不溶性磷转化成可溶性磷，以提高土壤肥力［7-9］。溶磷剂对粮食和饲料作物也有部分相应的促进作用［10-12］。大量的文献主要说明了根际促生菌其自身的促生作用和菌株的生理特征，但促生菌对植株-土壤-微生物整个体系作用的研究相对很少［13］。【本研究切入点】陇东地区对PGPR 菌株作为生物菌肥应用到农作物中以及促生效应的研究甚少。筛选一批促生作用显著的根际植物促生菌，可为进一步利用微生物-植物促生相互作用促进农作物的增长，提供优质的菌种资源，提高粮食产量，减少化学肥料对土壤特征的影响。【拟解决的关键问题】为探索PGPR对土壤中无机磷的溶磷能力以及植物的促生作用机制，本试验以冬小麦根际土壤为研究材料筛选具有溶磷能力和产生促生效应物质的菌株，采用改良的Belimov 方法获得一株显著促进玉米幼苗生长的菌株，通过16S rRNA 基因序列及表型分析鉴定其为Pseudomonassp，其作为优质的菌种资源，可促进农作物产量的提高和改善局部土壤的理化特征，扩大了生物菌肥的资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土样采集自冬小麦根际土壤5～15 cm 的土层。

试验使用的化学药品均为分析纯，均由西安姚北生物科技有限公司提供。

LB固体培养基：胰蛋白胨10.00 g，酵母膏5.00 g，NaCl 10.00 g，琼脂20.00 g，H2O 1 L，调节pH 为7.0，用于观察溶磷菌的菌落特征。

改良SRSM 培养基［14］：琼脂15 g，Glucose 10 g，Ca3（PO4）25 g，（NH4）2SO40.5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，MnSO40.004 g，FeSO40.002 g，NaCl 20 g，Yeast extract 0.5 g，Bromocresol purple 0.1 g，加蒸馏水至1 L，调节pH 为6.8～7.0，用于溶磷菌株的分离、纯化。

1.2 溶磷菌株筛选

取采集的冬小麦根际土壤10 g，加入到100 mL（含有25～35 个玻璃珠）的LB 液体培养基的锥形瓶中，置振荡器上震荡15 min，得到10-1 浓度的土壤稀释液，连续稀释至10-6，将10-1～10-6梯度的土壤稀释液均匀涂布于SRSM 培养基中，培养温度为30（±2）℃，倒置、恒温培养3～5 d。菌落周围若出现溶磷圈即为溶磷菌，挑取具有明显溶磷圈的菌株进行纯化，重复3 次，直至显微镜中观察出现形态、大小一致的细菌。将其保存4℃备用。

1.3 溶磷菌株鉴定

1.3.1 菌株形态观察及生理生化试验 菌落形态特征及革兰氏染色特性参照《常见细菌系统鉴定手册》进行观察，菌株的各项生理生化指标参照《伯杰细菌鉴定手册》及相关文献鉴定［15］。

1.3.2 16S rDNA 序列测定及系统发育树构建 分别提取菌株的总基因DNA，采用16S rDNA 通用引物27f（5'-AGAGTTT-G-ATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR 扩增，将PCR 产物送西安擎科生物公司完成16S rDNA 扩增及序列测定。提交菌株的16S rDNA序列到NCBI 网站，与已知的序列比对分析其同源性。利用Blast 将序列进行比对，MEGA5.05 分子进化遗传分析软件分析碱基组成、GC 含量，Kimura2 参数计算遗传距离，采用NJ 邻近法构建系统发育树。

1.4 溶磷菌株ACC 脱氨酶酶活性和产IAA 能力测定

参照 Penrose 等［16］的方法，ACC 脱氨酶的活性通过ACC 脱氨酶分解ACC 产生的α-酮丁酸来测定。菌体蛋白含量根据Bradford［17］的方法测定。根据α-酮丁酸和蛋白质的标准曲线即可测算ACC 脱氨酶的活性。

参照Glickman 等［18］的方法，将分离纯化的菌株分别接种于添加 L-色氨酸、终浓度为0.5 g/L 的LB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min 震荡培养2 d，离心后取50 μL 上清液加入等体积Sackowcki's 显色剂，在白瓷板上避光显色30 min后观察，若显示粉红色即为阳性，表明该菌株能够分泌IAA。

定量测定：取阳性菌株的上清液与Sackowcki's 显色剂避光显色30 min 后的混合液，测定在530 nm 的吸光值，以空白培养基作对照，标准曲线以纯IAA 的吸光值制作，计算各反应中的阳性菌株产IAA 的量（μg/mL）［19］。

1.5 根际细菌溶磷能力测定

1.5.1 定性测定 待测菌株在改良SRSM 固体培养基上活化，然后用接种针点接菌株至改良的SRSM固体培养基，每菌株在一个皿上接4个重复，在30 ℃培养箱中培养8 d 后观察菌株周围是否有透明圈产生。

1.5.2 定量测定 不加磷的改良SRSM 液体培养基100 mL 分装在250 mL 三角瓶中，灭菌后精确加入0.5 g 灭菌的Ca3（PO4）2粉、1 mL（1×108CFU/mL）培养24 h 菌液，28 ℃、120 r/min 摇床培养，分别在48、72、96、120、144 h 测定菌株溶解无机磷能力［14］。吸取2 mL 混匀菌株培养液，10 000 r/min 离心10 min，取上清液采用钼锑抗比色法测定其溶磷量［20］，同时用酸度计测定培养液的pH 值。每菌株3 次重复，以基础培养基（不接种菌株）为对照。根据磷酸二氢钾标准曲线确定菌株的溶磷量。

1.6 溶磷菌株对玉米幼苗生长的 影响

于2019 年5—6 月进行盆栽试验，供试土壤来自平凉农田，供试作物为玉米。试验设接种ZX-10、ZX-3、ZX-40、ZX-7、ZX-701、ZX-2020、ZX-30、ZX-401 及不接种任何菌剂对照9个处理，5 次重复。供试菌株分别活化后置于LB培养基振荡培养24 h，用无菌水调节菌悬液浓度为1×108CFU/mL，采用灌根方式进行接种，接 种量10 mL/株。自然条件下室内培养，每隔5 d重复处理1 次，整个试验期间保持土壤湿润，30 d 后收获植株测定生物学数据。

试验数据采用SPSS13.0 one-way ANOVA 进行分析，采用Fisher's Student-Newman -Keulsa,b进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 溶磷菌株的筛选

将分离纯化的菌株以稀释涂布的方式接种于改良SRS M 固体培养基5 d 后，测定菌落直径和溶磷圈直径，根据溶磷圈大小筛选到8 株具有溶磷能力的菌株，其对应平板上都观察到明显的溶磷圈。其中，ZX-2020 菌落直径为2.3 mm，溶磷圈直径为4.8 mm（图1 中箭头所示），计算得SI=2.08，为8 株菌株中最大，因此对ZX-2020 平板上的溶磷菌株进行纯化和传代培养，表明菌株纯度和溶磷能力稳定。

图1 菌株ZX-2020 的溶磷圈Fig.1 Phosporous-solubilizing halos of strain ZX-2020

2.2 溶磷菌株的菌体形态特征和生理生化特性

菌株ZX-2020 为乳白色或淡黄菌落，表面光滑，半透明，湿润粘稠，圆形，边缘规则，革兰氏染色阴性，具运动性。生化反应结果见表1。另外，在SRSM 液体培养基中，菌株ZX-2020 在pH 6.5～11.5 之间均可生长，在37 ℃下生长状况最好。根据菌体形态特征和生理生化，菌株 ZX-2020 为Pseudomonasspp.

表1 溶磷菌株Pseudomonas sp.ZX-2020 的形态特征和生化反应Table 1 Morphological characteristics and biochemical reactions of Ps eud omonas sp.strain ZX-2020

2.3 菌株ZX-2020 16S rDNA 序列测定

为了鉴定菌株的生理生化特性，以菌株ZX-2020 的总DNA 为模板，利用细菌16S rDNA 引物进行PCR 扩增，得到长度约为1.5 kb 的扩增产物。将此序列提交至Genbank，获得的登录号为MT084758。根据Genbank 序列同源性比较，利用NCBI 数据库提供的Blast 功能进行核苷酸比对，结果显示，菌株ZX-2020 与Pseudomonas aeruginosastrain P1（MK881024.1）、Pseudomonas aeruginosastrain LCS1（MK430420.1）及Pseudomonas aeruginosastrain BUYA-2（MN490066.1）的16S rDNA 基因序列一致性均高达100%。根据16S rDNA 基因序列的相似性，利用MEGA5.0 构建系统发育树（图2），显示菌株ZX-2020 在系统发育上最接近于铜绿假单胞菌属（Pseudomonas aeruginosa）。

图2 基于菌株ZX-2020 16S rDNA 基因序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on the 16S rDNA gene sequence of strain ZX-2020

2.4 菌株ZX-2020 ACC 脱氨酶活性和产IAA能力

植物促生菌可以定植在植物的根以及种子表面，菌株产生的1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶可降解乙烯的前体1-氨基环丙烷-1-羧酸，从而降低乙烯在植物体内的含量，促进植物的生长和发育。IAA 也可通过直接刺激植物细胞的延伸和分裂，促进植物的生长并提高植物自身的防御系统。试验结果显示，Pseudomonasspp.ZX-2020溶磷量为198.26（±10.04）μg/mL，ACC 脱氨酶活性为152.62（±7.21）μmol/mg·h，产IAA 量为6.71（±0.32）mg/L，具有较高的产IAA 能力。

2.5 菌株ZX-2020 溶磷能力

难溶性磷在酸性土壤中会转化成磷酸铝和磷酸铁，在石灰性土壤中会转化为磷酸钙，而溶磷微生物能把此类难溶性磷转化成植物可以吸收利用的有效磷。为了 分析测试菌株ZX-2020 转化土壤中难溶性磷酸盐并且改善土壤的供磷能力，将菌液与供试土壤按照10%的比例进行混合，3 d后，土壤中的有效磷含量从最初的8.63 mg/kg 上升为12.66 mg/kg。起初的土壤有效磷含量比较少，属于低能力供磷水平，在施加菌株ZX-2020 后，土壤有效磷含量明显增加，达到中等供磷水平，证明菌株ZX-2020 可以改善土壤的供磷水平。

2.6 菌株ZX-2020 对幼苗生长的影响

通过不同溶磷菌株对幼苗进行灌根处理，30 d 后测定植株的生理生长指标。盆栽试验显示，与对照相比，接种ZX-7、ZX-2020、ZX-30、ZX-401 菌株的幼苗根长均显著增长，接种ZX-40、ZX-2020、ZX-30、ZX-401 菌株的幼苗茎长均显著增长，接种ZX-40、ZX-701、ZX-30、ZX-401、ZX-2020 的幼苗鲜重均显著增加，接种ZX-10、ZX-7、ZX-2020 菌株的幼苗叶面积均显著增加（表2）。表明接种8 种菌株的玉米幼苗根长、茎长、鲜重、叶面积均有不同程度的增加，以ZX-2020 菌株的促生效应更为突出，接种ZX-2020 菌株的玉米幼苗根长增长54.49%，茎长增长26.96%，鲜重增加1.93%，叶面积增加36.06%。同时，接种溶磷菌株的幼苗植株与对照相比根部生长更为旺盛，根毛数更多，根须更长，根系更为发达。

表2 8 株溶磷菌株对玉米幼苗生长的影响Table 2 Effects of 8 phosphorus-solubilizing strains on the growth of Zea mays L. seedlings

3 讨论

土壤、根系及微生物三者相互作用的区域称为植物根际［21］，植物根系可分泌大量的糖类、氨基酸、激素和维生素，根际细菌的定植在土壤养分转化和溶解等方面发挥着至关重要的作用［22］。大多数的解磷、溶磷菌都可以促进作物生长、提高作物产量、增强抗病力［23］，假单胞菌属作为主要溶磷微生物之一，很多研究都表明假单胞杆菌属菌株对难溶性磷酸盐有较好的溶磷效果。郭莹等［24］研究表明铜绿假单胞菌JM1对 磷酸钙和磷酸铝的溶磷量分别达到240.63 和2.73mg/L。孙珊等［25］筛选的一株假单胞菌属菌株CJT-1 对磷酸钙和宜昌磷矿粉的溶磷量分别达到224.51 和120.59 mg/L，刘辉等［26］筛选的一株荧光假单胞菌JW-JS1 对磷酸钙的溶磷量最高达708.34 mg/L。本研究筛选得到的ZX-2020 菌株对磷酸钙溶的溶磷量为198.26 mg/L，该菌株对难溶性磷酸盐的溶解能力与上述报道的结果相近，甚至效果更优。溶磷菌的溶磷机理非常复杂，有的溶磷菌通过释放质子来降低土壤pH 值而达到降磷效果，部分溶磷菌通过分泌有机酸而起到溶磷作用，也有溶磷菌通过分泌磷酸酶来溶磷，或者是多种机制并存起到的综合作用［27-28］。目前，大部分研究认为真菌溶磷的能力主要与其向培养基中分泌的小分子有机酸有关，分泌有机酸一方面可以降低培养基pH利于难溶性磷酸盐的溶解，另一方面可以通过结合铁镁钙铝等离子将磷酸盐释出来［29-30］，因此造成不同浓度的溶磷菌株溶解能力的差异可能与金属离子的螯合能力不同或其分泌的有机酸含量有关。溶磷菌剂的使用，直接增加其在土壤中的数量，有利于植物对磷素的吸收利用［31］。万水霞等［32］通过盆栽试验，发现土壤根际筛选出的优良PGPR 菌株（CH70）对苋菜的株高及地上部鲜重都有一定的促进作用，并且从根际土壤分离获得的溶磷菌株，其菌剂能有效促进苗期生长和增加产量［33］。陈佳怡等［34］对水稻根际土壤进行溶磷菌筛选纯化，分离得到的假单胞菌有高效的溶磷能力，可用来研制微生物菌肥。在陇东地区，过量使用化肥使农业生态环境遭到破坏，迫切需要绿色高效的生物菌肥代替化肥，因此，在今后的研究中，改善土壤微环境，溶磷微生物能够推动土壤中有效磷的释放，从而促进植物生长发育，增加作物产量，筛选更多优良PGPR 菌株尤为重要。

4 结论

本研究从平凉市化肥施用冬小麦土壤中初步筛选分离得到8 株溶磷菌株，通过植物促生试验得到一株溶磷能力强（198.26 mg/L）、产吲哚乙酸（6.71 mg/L）、ACC 脱氨酶活性强（152.62 μmol/mg·h）的铜绿假单胞菌属，可以作为生物菌肥应用到农耕活动中，不但可以增加农作物对磷元素的吸收，而且吲哚乙酸也可以促进植物的生长，ACC 脱氨酶可以帮助植物抵抗非生物胁迫条件，如重金属、干旱、高盐等，增加植物的抗逆性。当ZX-2020 菌株进入土壤中定殖于植物根系后，产生的吲哚乙酸、ACC 脱氨酶和溶解无机磷的能力相互作用，促进植物生长，提高农作物的生物量，同时也为化肥土壤的生物修复提供了菌种资源。