茶轮斑病病原菌鉴定及其对茶皂素和茶多酚的敏感性

姚玉仙，张明泽，刘 荣，陈 志，江 荣，韦 梅，高雪静

（黔南民族师范学院生物科学与农学院，贵州 都匀 558000）

茶轮斑病（tea grey blight）是一种半知菌亚门拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）病原菌，主要危害茶树（Camellia sinensis）成叶和老叶，也可危害嫩叶和茶梢，引起叶片枯萎脱落，甚至整株死亡，已成为茶树的主要病害之一[1-2]。茶轮斑病在世界各产茶区均有发现，我国产茶各省发生均较普遍。近年来，国内茶叶种植面积不断扩大，规模化程度不断提高，冬季气温回暖现象多有发生，致使茶轮斑病发生范围扩大、发生程度加重，严重影响茶叶产量和品质[3]。目前，防治茶树病害常用的化学杀菌剂均不同程度地存在有毒性、污染环境及易引起抗药性等问题[4]，而且一些有机茶园对化学农药要求较高。加上消费者对茶叶质量安全尤其对茶叶农药残留越发关注[5]，发达国家或地区逐步提高的茶叶农药残留限量标准成为我国茶叶出口的瓶颈，严重阻碍了茶叶贸易的发展[6]。植物源农药不会造成环境污染，不易使病菌产生抗药性，利用植物源农药防治茶树病虫害更能保障茶叶的质量安全。茶皂素（teasaponin）又名茶皂甙，是一类齐墩果烷型五环三萜类皂甙的混合物。茶多酚（tea polyphenols）又名茶单宁，是一类从茶叶中提取出来的多羟基酚类混合物。茶皂素[7]和茶多酚[8]都是一种新型的天然抑菌剂，作为一种绿色植物源病原菌防治药物，具有极大的开发潜力[9]。因此，笔者采用分子生物学方法鉴定病原菌，并测定茶皂素和茶多酚对该病原菌的抑制效果，以期为茶轮斑病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样品采集：于贵州省都匀市红敏茶园采集具有典型茶树轮斑病症状的样品。

供试药剂：茶皂素（纯度为20%～40%）和茶多酚（纯度为95%）均购买于阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 茶轮斑病病原菌的分离与纯化 采用组织分离法分离病原菌，将采集的茶树叶片用无菌水冲洗，用灭菌解剖刀在病、健交界处切下3.5 mm × 3.5 mm的带病组织块作为分离材料，再用75%乙醇消毒5 s，无菌水冲洗3次后接种至PDA培养基，放入27℃恒温培养箱中培养，3 d后挑取菌落边缘的菌丝进行纯化，纯化后的菌株（DYHM-LB1）转至PDA斜面培养基培养后保菌。

1.2.2 茶轮斑病病原菌的分子生物学鉴定 采用CTAB法提取病原菌的总DNA，以ITS1（5'-TCCGTAG GTGAACCTGCGG-3'）及ITS4（5'-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3'）为引物对茶轮斑病rDNA的ITS区进行PCR扩展，扩增产物回收纯化后送上海生工公司测序，将测序结果在NCBI网站上进行Blastn同源性比对，分析并确定其分类地位。采用Clustalx1.83和MEGA7进行聚类分析并构建NJ进化树，基因的系统发育树分析方法选择 Bootstrap method，重复次数为1000。

1.2.3 茶皂素和茶多酚对病原菌生长的抑制性测定

采用菌丝生长速率法测定茶皂素和茶多酚对病原菌菌丝生长的抑制活性。茶皂素和茶多酚均设置5个浓度，分别取不同浓度的茶皂素、茶多酚1 mL加到冷却至50℃左右的49 mL PDA培养基中，摇匀后倒入3个直径为90 mm的灭菌培养皿内（3次重复），使茶皂素终浓度分别为4、10、20、50、100 g/L，茶多酚终浓度分别为1、2、5、10、20 g/L，以添加1 mL无菌水的PDA培养基所倒平板为对照。待平板冷却后，在平板中央放置已纯化鉴定的茶轮斑病菌饼（直径为0.55 cm），27℃恒温培养。用十字交叉法测量菌落直径，按公式计算菌丝生长抑制率。

菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）×100/（对照菌落直径-0.55）

1.2.4 毒力回归方程和EC50计算 以对照接近长满平板当天的菌落直径计算茶皂素和茶多酚不同浓度抑制作用的毒力回归方程，采用SPSS Statistics 26软件开展毒力回归方程的模拟和EC50的计算[10-11]。回归概率分析中以抑菌直径（对照菌落直径-处理菌落直径）为响应频率（S）、对照菌落直径（减去接种菌饼直径0.55 cm）为实测值总数（T）、浓度为协变量（C），转换（N）是以10为底的对数，参数估算值中的“PROBIT模型”即为不同抑菌物质的毒力回归方程，采用卡方（x2）对回归方程的拟合度进行检验。

2 结果与分析

2.1 茶轮斑病病原菌的分离与纯化

利用PDA培养基27℃恒温培养分离纯化茶轮斑病病原菌，得到纯化菌株DYHM-LB1（图1），菌落呈纹状，大致呈圆形，边缘稍有不规则，菌丝为白色，背面呈淡黄色。

图1 菌株DYHM-LB1的菌落形态

2.2 茶轮斑病病原菌的分子生物学鉴定

序列比对发现菌株DYHM-LB1与李应祥等[12]发现的都匀市茶轮斑病病原菌序列的Query Cover为99%，Per.Ident为94.85%，而与P. theae（AY924274.1）及Pseudopestalotiopsis theae（HQ832793.1）的Query Cover均为100%，Per.Ident均为94.88%，与Neopestalotiopsis formicarum（LC521861.1）、Neopestalotiopsissp.（MN 337279.1）及Pseudopestalotiopsis sydowiana（MN856236.1）序列的Query Cover为100%，Per.Ident为99.77%。系统发育树显示菌株DYHM-LB1与3株拟盘多毛孢菌（LC521861.1、MN337279.1和MN856236.1）聚为同一分支（图2）。因此，将菌株DYHM-LB1初步鉴定为拟盘多毛孢属真菌。

图2 基于ITS序列茶轮斑病病原菌系统发育树

2.3 茶皂素和茶多酚对病原菌生长的抑制性测定

2.3.1 茶皂素和茶多酚对茶轮斑病的抑制效果 由图3和图4可知，添加不同浓度茶皂素及茶多酚的试验组均呈现出抑菌效果，其抑菌效果随接种后天数及添加浓度的变化而变化，其中添加不同浓度茶皂素的试验组抑制率随接种后天数的增加总体呈上升趋势，而添加不同浓度茶多酚的试验组抑制率随接种后天数的增加总体呈下降趋势，试验组抑制效果均随茶皂素和茶多酚浓度的增加而总体呈增强趋势。茶皂素对茶轮斑病的抑制效果具有缓效性，而茶多酚的抑制效果具有速效性。

图3 接种后1～6 d不同浓度茶皂素对茶轮斑病的抑制率

图4 接种后1～5 d不同浓度茶多酚对茶轮斑病的抑制率

根据接种后每天抑菌率计算添加不同浓度茶皂素和茶多酚的平均日抑制率。由图5可知，茶皂素浓度在4～50 g/L时平均日抑制率变化不大，在浓度达到100 g/L时平均日抑制率才有明显升高；由图6可知，不同浓度茶多酚平均日抑制率随添加浓度的增加而增加。

图5 不同浓度茶皂素对茶轮斑病的平均日抑制率

图6 不同浓度茶多酚对茶轮斑病的平均日抑制率

2.3.2 茶皂素和茶多酚对茶轮斑病毒力回归方程分析以对照菌丝接近长满平板时的菌落直径计算茶皂素和茶多酚不同浓度抑制作用的毒力回归方程，采用卡方检验（x2）验证回归方程的拟合度。由表1可知，x2测定值均小于检验的临界值7.815（x20.05，自由度为3），且P值均大于0.05，表明实际测定结果与理论测定结果差异不显著，卡方（x2）检验结果表明毒力回归方程拟合度良好。EC50反映了药物对供试病原菌的抑制能力，EC50值越低，表明药物抑菌活性越好，茶皂素抑制茶轮斑病的EC50为0.044 g/L，而茶多酚的EC50为297.397 g/L，表明茶皂素对茶轮斑病的抑制效果显著高于茶多酚。

表1 茶皂素和茶多酚对茶轮斑病的毒力

3 讨 论

茶轮斑病是目前我国茶园中发生相当普遍的病害之一，主要是由茶拟盘多毛孢侵染发病，关于该病的病原菌一直有不同的报道[13]，可能与拟盘多毛孢属的划分标准不同有关，Maharachchikumbura等[14]依据rDNA-ITS、β-tub和EF-1α基因序列对拟盘多毛孢属的分类进行了修订，并从此属中划分出了新拟盘多毛孢和假拟盘多毛孢2个属。李应祥等[12]鉴定贵州都匀茶区茶轮斑病的病原菌为茶拟盘多毛孢菌（P. theae），李冬雪等[15]将贵州惠水茶区茶轮斑病的病原菌GZHS-2017-01鉴定为茶假拟盘多毛孢（Ps.camelliae-sinensis），笔者的研究中的菌株DYHM-LB1经序列比对和聚类分析初步鉴定为拟盘多毛孢属真菌，但该菌株序列与都匀茶区茶轮斑病病原菌[12]、P.theae（AY924274.1）和N. formicarum（LC521861.1）等菌株的序列相似性存在差异，这可能与菌株生长的地域、环境和寄主等因素有关[15]。

黄继光等[16]研究发现茶皂素对12种植物病原菌有良好的抑菌活性，笔者的研究显示茶皂素对茶轮斑病也有较好的抑制效果，且抑制效果具有缓效性。茶皂素和茶多酚对茶轮斑病均有抑制作用，茶皂素的抑制效果显著高于茶多酚，这与邹东霞等[17]关于茶皂素和茶多酚对八角炭疽病菌均有抑制作用，但茶皂素的抑制作用强于茶多酚的研究结果相类似。茶皂素的抑菌作用强于茶多酚，这可能与茶皂素和茶多酚对病原菌抑菌的作用机理不同有关。张慧勤[18]研究发现茶皂素通过破坏细胞膜的通透性，影响膜上和胞内相关酶的活性，促进膜上蛋白质酶和几丁质酶加速分解蛋白质和几丁质，导致细胞壁的完整性被破坏而起到抑菌作用。张新富[19]用油茶皂苷处理玉米小斑病菌菌丝，发现其顶端及中部细胞膨大呈泡囊状，阻碍了菌丝的生长。李柯欣[20]研究发现茶多酚对细菌表现出极强的抑制作用，而对酵母和霉菌等真菌的抑制作用不明显，茶多酚是通过抑制细菌的蛋白酶、淀粉酶和水解酶等酶类活性，导致细菌不能从外界分解、摄取蛋白质及碳水化合物而发挥抑菌作用，但当微生物所处外界环境中有足够的氨基酸和葡萄糖时，即使微生物的水解酶类被抑制，其仍不会受到茶多酚的抑制。该研究中茶多酚对茶轮斑病的抑制效果随接种天数的增加抑制率下降的现象可能与茶多酚的这种抑菌机制有关。茶皂素和茶多酚大田试验的抑菌效果及不同茶树株系的茶皂素和茶多酚含量是否会影响其抗病性等有待进一步研究。