筋骨痛消丸HPLC指纹图谱的建立及其中7个成分的含量测定

2021-07-11孙实王一方赵新杰王昭张丽王丹丹武爱玲吴晓龙

中国药房 2021年10期

孙实王一方赵新杰王昭张丽王丹丹武爱玲吴晓龙

中圖分类号 R284 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）10-1235-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.10.13

摘要目的：建立筋骨痛消丸的指纹图谱，并测定其中7个成分的含量。方法：采用高效液相色谱法（HPLC），以Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ为色谱柱，以乙腈-0.02%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为230 nm，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》建立10批筋骨痛消丸的HPLC指纹图谱并进行相似度评价，通过与混合对照品比对指认共有峰;采用同一HPLC法测定所指认共有峰对应成分的含量。结果：10批筋骨痛消丸样品中共确定共有峰20个，与对照指纹图谱的相似度均不低于0.980。通过与混合对照品比对，指认化学成分7个，分别为马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA。上述7个成分检测质量浓度的线性范围分别为4.509～45.090、15.090～150.900、14.985～149.850、14.982～149.820、2.967～29.670、1.944～19.440、3.094～30.940 μg/mL（r均大于0.999），检测限分别为0.060 1、0.161 0、0.399 6、0.159 8、0.031 6、0.051 8、0.082 5 μg/mL，定量限分别为0.200 4、0.503 0、0.999 0、0.399 5、0.079 1、0.259 2、0.412 6 μg/mL;精密度、稳定性（24 h）、重复性试验的RSD均小于3.0%（n=6）;平均加样回收率为98.81%～100.28%，RSD为0.20%～1.21%（n=6）。10批样品中上述成分的含量分别为0.441 0～0.969 4、3.283 4～4.733 4、1.947 7～3.674 9、1.336 6～2.270 9、0.293 2～0.372 1、0.190 2～0.293 9、0.352 8～0.518 8 mg/g。结论：本研究成功建立了筋骨痛消丸的HPLC指纹图谱和含量测定方法，可用于其质量控制。

关键词筋骨痛消丸;指纹图谱;含量测定;高效液相色谱法

Establishment of HPLC Fingerprints and Content Determination of 7 Components of Jingu Tongxiao Pill

SUN Shi1，2，WANG Yifang1，ZHAO Xinjie1，2，WANG Zhao1，ZHANG Li1，WANG Dandan1，WU Ailing1，2，WU Xiaolong1[1. Dept. of Pharmacy， Luoyang Orthopedic Hospital of Henan Province （Orthopedic Hospital of Henan Province）， Henan Luoyang 471003， China; 2. Research and Development Department， Henan Luozheng Pharmaceutical Co.， Ltd.， Henan Luoyang 471013， China]

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the fingerprint of Jingu tongxiao pill， and to determine the contents of 7 components. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ column with acetonitrile-0.02% phosphoric acid solution as mobile phase （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm and the column temperature was set at 25 ℃. The sample size was 10 μL. HPLC fingerprint of 10 batches of Jingu tongxiao pill was established by using Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition）， and common peak was identified by comparing with the mixed reference substance. The contents of corresponding components of the identified common peak were determined by the same HPLC method. RESULTS： There were 20 common peaks in HPLC fingerprint of 10 batches of samples， and the similarity with the control fingerprint was not less than 0.980. By comparing with the mixed reference substance， 7 components were identified， which were loganic acid，gentiopicroside，paeoniflorin，salvianolic acid B，cryptotanshinone，tanshinone Ⅰ and tanshinone ⅡA. The linear range of the above 7 components were 4.509-45.090， 15.090-150.900， 14.985-149.850， 14.982-149.820， 2.967-29.670， 1.944-19.440， 3.094-30.940 μg/mL（all r>0.999），respectively. The limits of detection were 0.060 1， 0.161 0， 0.399 6， 0.159 8， 0.031 6， 0.051 8， 0.082 5 μg/mL， respectively. The limits of quantitation were 0.200 4， 0.503 0， 0.999 0， 0.399 5， 0.079 1， 0.259 2， 0.412 6 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 3.0% （n=6）. Average recoveries were 98.81%-100.28%， RSDs were 0.20%-1.21% （n=6）. In 10 batches of samples， the contents of the above 7 components were 0.441 0-0.969 4，3.283 4-4.733 4，1.947 7-3.674 9，1.336 6-2.270 9，0.293 2-0.372 1，0.190 2-0.293 9 and 0.352 8-0.518 8 mg/g，respectively. CONCLUSIONS： In this study， HPLC fingerprint and content determination method of Jingu tongxiao pill are successfully established and can be used for quality control.

KEYWORDS Jingu tongxiao pill;Fingerprint;Content determination; HPLC

筋骨痛消丸是以国家级非物质文化遗产“平乐郭氏正骨法”经验方为基础开发的中药新药，为国家中药保护品种，由11味中药组成。方中丹参、鸡血藤活血化瘀、舒筋止痛，为君药;香附、乌药行气止痛、温经散寒，为臣药;桂枝、威灵仙、秦艽温经通络、祛风除湿、消肿止痛，白芍、地黄养血敛阴、补虚止痛，川牛膝活血化瘀、通利关节，三味药材共为佐药;甘草缓急止痛、调和诸药，为使药。全方共奏活血行气、温经通络、消肿止痛之功，临床上主要用于血瘀寒凝以及骨质增生引起的膝关节疼痛、肿胀、活动受限等症，疗效显著[1-3]。此外，有临床研究报道，筋骨痛消丸单用或与其他药物联用对肩关节周围炎、髌骨软化症、类风湿性关节炎、腰椎间盘突出症、膝关节骨坏死等疾病均有明显的改善作用[4-8]。

目前，国家药品标准中筋骨痛消丸仅以丹参酮ⅡA作为“含量测定”项下的考察指标[9]。这种以方中药材所含单一有效成分作为定量指标的方法难以全面控制其内在质量，更无法体现“多成分、多靶点”理论下的中药整体质量，故有必要探索一种更加全面、相对更能反映中药整体内涵的质量控制方法。中药色谱指纹图谱能够提供丰富的鉴别信息，其兼顾“整体性”和“模糊性”的特点，非常适合中药复杂体系的质量控制，是一种国际公认的控制中药或天然药材质量的方法[10-12]。基于此，本研究建立了筋骨痛消丸的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，通过与对照品比对指认共有峰，测定所指认共有峰对应成分的含量，以期为建立科学、合理的筋骨痛消丸质量控制方法提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括Nexera XR型HPLC儀及配套的LC-20ADXR型二元高压泵、FCV-11AL型快速流路切换器、DGU-20A5R型脱气单元、SIL-20AXR型自动进样器、CTO-20AC型柱温箱、SPD-M20A型二极管阵列检测器、Labsolution DB（Ver. 6.70）色谱工作站（日本Shimadzu公司），KH-600DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），MS204S型万分之一电子分析天平、AB135-S十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）等。

1.2 主要药品与试剂

筋骨痛消丸（批号201127、201128、201129、201130、201131、201132、201133、201135、201201、201203，编号S1～S10，规格每袋装6 g）购自河南省洛正药业有限责任公司;马钱苷酸对照品（批号111865-201704，纯度≥98%）、龙胆苦苷对照品（批号110770-201918，纯度≥98%）、丹酚酸B对照品（批号111562-201716，纯度≥98%）、丹参酮ⅡA对照品（批号110766-202022，纯度≥98%）均购自中国食品药品检定研究院;芍药苷对照品（批号MUST-18032901，纯度≥98%）、隐丹参酮对照品（批号MUST-18041115，纯度≥98%）、丹参酮Ⅰ对照品（批号MUST-18032207，纯度≥98%）均购自成都曼斯特生物科技有限公司;乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）均购自美国TEDIA公司;磷酸（色谱纯）、甲酸（色谱纯）均购自天津科密欧化学试剂有限公司;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件以Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ（250 mm× 4.6 mm，5 ?m）为色谱柱，以乙腈（A）-0.02%磷酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～15 min，5%A→12%A;15～35 min，12%A→15%A;35～75 min，15%A→32%A;75～90 min，32%A→60%A;90～130 min，60%A→70%A）;检测波长为230 nm;流速为1.0 mL/min;柱温为25 ℃;进样量为10 μL。

2.1.2 混合对照品溶液的制备精密称取马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA对照品各适量，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为0.300 6、0.503 0、0.499 5、0.499 4、0.197 8、0.216 0、0.206 3 mg/mL的单一对照品贮备液。吸取上述单一对照品贮备液适量，用甲醇配制成马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA质量浓度分别为45.090、150.900、149.850、149.820、29.670、19.440、30.940 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备取筋骨痛消丸样品，研磨至细粉，过六号筛（下同）。精密称取细粉0.4 g，置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，称定质量，超声（频率45 kHz，功率600 W）提取45 min，放至室温;再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 精密度试验取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S1）适量，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次。以丹酚酸B为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，20个共有峰相对保留时间的RSD为0.02%～0.42%（n=6），相对峰面积的RSD为0.19%～2.91%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.1.5 稳定性试验取“2.1.3”项下供试品溶液（编号S1）适量，分别于室温下放置0、3、6、9、12、24 h时按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定。以丹酚酸B为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，20个共有峰相对保留时间的RSD为0.04%～0.16%（n=6），相对峰面积的RSD为0.25%～2.93%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验取筋骨痛消丸样品（编号S1）约0.4 g，共6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。以丹酚酸B为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，20个共有峰相对保留时间的RSD为0.09%～0.73%（n=6），相对峰面积的RSD为0.66%～2.85%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.1.7 HPLC指纹图谱的建立取10批筋骨痛消丸样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，选取S1样品色谱图作为参照，将时间窗设置为0.2 min，经多点校正（3点）后自动匹配，生成HPLC叠加指纹图谱，采用中位数法生成HPLC对照指纹图谱（R）详见图1、图2。

2.1.8 相似度评价采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》对10批筋骨痛消丸样品进行相似度分析。结果，10批样品图谱与对照指纹图谱间的相似度均不低于0.980，提示不同批次样品的相似度较高，生产工艺相对稳定，详见表1。

2.1.9 共有峰指认由图2可见，10批筋骨痛消丸样品共有20个共有峰，通过与混合对照品溶液（图3A，同一色谱条件下测得）比对，指认共有峰7个，分别为马钱苷酸（峰5）、龙胆苦苷（峰6）、芍药苷（峰8）、丹酚酸B（峰14）、隐丹参酮（峰17）、丹参酮Ⅰ（峰18）和丹参酮ⅡA（峰19）。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件同“2.1.1”项。

2.2.2 混合对照品溶液的制备同“2.1.2”项。

2.2.3 供试品溶液的制备同“2.1.3”项。

2.2.4 阴性对照溶液的制备按筋骨痛消丸处方组成分别称取方中药材，按照制剂工艺分别制得缺秦艽、白芍、丹参的阴性对照样品，再按“2.1.3”项下方法分别制成缺味药材阴性对照溶液。

2.2.5 系统适用性试验取“2.2.2”项下混合对照品溶液、“2.2.3”项下供试品溶液（编号S1）、“2.2.4”项下阴性对照溶液各适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，各待测峰与相邻色谱峰间的分离度均大于1.5，理论板数均不低于10 000，阴性对照溶液对测定均无干扰，详见图3。

2.2.6 线性关系考察精密量取“2.2.2”项下混合对照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分别用甲醇定容至10 mL量瓶中，得不同质量浓度的系列工作溶液。取上述系列工作溶液各适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度为横坐标（x，μg/mL）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，结果见表2。

2.2.7 检测限与定量限考察将“2.2.2”项下混合对照品溶液用甲醇逐级稀释，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，分别以信噪比3 ∶ 1和10 ∶ 1计算检测限和定量限，结果见表3。

2.2.8 精密度试验精密吸取“2.2.6”项下稀释后的混合对照品溶液（马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的质量浓度分别为27.054、90.540、89.910、89.892、17.802、11.664、18.564 μg/mL）各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、丹酚酸B、隐丹参酮、丹參酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积的RSD分别为1.99%、2.15%、1.98%、1.06%、1.17%、1.03%、1.20%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.9 稳定性试验取“2.2.3”项下同一供试品溶液（编号S1），分别于室温下放置0、3、6、9、12、24 h时按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA峰面积的RSD分别为0.59%、0.28%、0.65%、1.24%、1.35%、0.95%、1.38%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.2.10 重复性试验精密称取同一批筋骨痛消丸样品（编号S1）6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算含量。结果，马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA含量的RSD分别为2.71%、1.42%、1.65%、1.78%、0.82%、1.48%、1.25%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.2.11 加样回收率试验精密称取已知含量的筋骨痛消丸样品（编号S1）0.2 g，共6份，置于具塞锥形瓶中，分别加入与待测成分近似等量的混合对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果，7个待测成分的平均加样回收率为98.81%～100.28%，RSD为0.20%～1.21%（n=6），详见表4。

2.2.12 样品含量测定取10批筋骨痛消丸样品粉末各0.4 g，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量。每样品重复测定3次，取平均值，结果见表5。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 检测波长的选择本课题组前期采用二极管阵列检测器在190～400 nm波长范围内对待测成分进行扫描。结果显示，在230 nm波长处色谱图中的峰容量较多、峰形较好，故本研究选择230 nm作为最终检测波长。

3.1.2 流动相的选择由于筋骨痛消丸中化学成分众多、理化性质各异，故本研究采用梯度洗脱的模式，先后考察了甲醇-水、乙腈-水以及甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液（0.02%～0.1%）的分离效果。结果表明，当流动相为乙腈-磷酸水溶液时，所得色谱图基线平稳，各色谱峰分离效果相对更好。同时，本课题组对流动相中磷酸的浓度进行了考察，发现不同磷酸浓度（0.02%～0.1%）对分离效果几乎没有影响，故最终选择乙腈-0.02%磷酸水溶液作为流动相。

3.1.3 柱温的选择本课题组前期分别对25、30、35、40 ℃等不同柱温进行了考察。结果表明，当柱温为25 ℃时，各待测成分的色谱峰峰形及分离度最好，故本研究柱温选择为25 ℃。

3.2 参照峰的选择

由于丹酚酸B的峰面积较大、保留时间适中，同时与其他色谱峰的分离度较好，故选择丹酚酸B作为指纹图谱的参照峰。

3.3 指标性成分的确认

通过与对照品比对，本研究共指认了马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA共7个成分，分别来自于丹参、白芍和秦艽。这3种药材是筋骨痛消丸处方中用量较大的组分。同时，指认的7个成分也是2020年版《中国药典》中上述3种药材“含量测定”项规定的定量检测指标，可以说是各药材的代表性成分[13]。除此之外，有研究表明，这7个成分均有良好的抗炎、镇痛活性，与筋骨痛消丸发挥其抗骨关节炎作用直接相关[14-16]。因此，选择这7个成分作为本研究的定量分析指标对筋骨痛消丸的质量控制具有一定的意义。

3.4 指纹图谱与含量测定结果分析

本研究建立的筋骨痛消丸HPLC指纹图谱共获取20个共有峰，通过与混合对照品比对，共指认出其中7个化合物，分别为马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA。另外，在未指认的色谱峰中，通过与阴性样品比对，可以得出峰7、8可能来源自白芍，峰13、16可能来源自丹参，具体归属有待进一步确认。与此同时，10批筋骨痛消丸样品图谱与对照指纹图谱间的相似度均不低于0.980，说明这10批样品的成分相似。为进一步考察筋骨痛消丸的质量，本研究建立了这7个成分的含量测定方法，并对10批筋骨痛消丸进行了定量测定。结果发现，虽然图谱间相似度很高，但不同批次间各成分的含量依然存在较大差异，因此可以考虑将多成分含量测定加入至筋骨痛消丸的质量控制中，以更全面地提高该制剂的质量。

综上所述，本研究成功建立了筋骨痛消丸的HPLC指纹图谱和含量测定方法，可用于其质量控制。

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