基质固相分散-HILIC-MS/MS法测定乳制品中5种氨基糖苷类抗生素残留

王一冉

（山东药品食品职业学院，山东威海264210）

0 引 言

氨基糖苷类抗生素(aminoglycosides，AGs)是一类广谱抗生素，化学结构上包含两个以上氨基糖并由配苷键与中心的己糖或戊糖相连[1-2]，是畜牧养殖中的常用药物[3-4]。由于AGs会对人体有损伤，乳制品为国民日常消费品，加强了AGs在动物源性食品中残留的监控也十分必要。

大多数AGs化合物化学性质为弱碱性[5-7]，在加之样品基质为高蛋白和高脂肪含量的乳制品，一般前处理方式下化合物的回收率不理想[8-10]。一般采用的高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对样品前处理有严苛要求，同时测定时流动相中要加入离子对试剂，这也会导致目标化合物回收率较低的问题[11-13]。亲水交互作用色谱（Hydrophilic interaction chromatgraphy，HILIC）是一种介于正相色谱与反相色谱之间的一种技术[14-16]，用于分离强极性的化合物，易与质谱联用，可解决多种AGs的分离问题。同时前处理采用基质固相分散(Matrix solid phase dispersion，MSPD)技术可有效分离提取复杂基质中强极性的AGs组分，提高了方法的实用性[17-18]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Agilent 1200-API 4000高效液相色谱-串联质谱仪,ABSciex公司；Obelisc R色谱柱（2.1mm×100mm，5μm），飞诺美公司；ZIC-HILIC色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm），沃特世公司；BEH-HILIC色谱柱（2.1mm×100mm，3μm），岛津有限公司。

大观霉素（99.0%）、链霉素（98.0%）、双氢链霉素（99.0%）、阿米卡星（98.0%）、卡那霉星（97.5%），标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH；样品来源随机购买于超市的乳制品。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

称取0.5 g样品，加入二氧化硅和EDTA二钠盐填料混匀填入到SPE小柱中。控制1.0 mL/min速度淋洗小柱后，用2 mL 0.1%甲酸溶液洗脱后收集洗脱液，并定容至2.0 mL，过0.22μm滤膜后分析。

1.2.2 色谱条件的优化

用于亲水交互作用色谱的固定相为极性，易吸附样品溶液中的极性分子，从而促进目标物从流动相中分配至固定相表面上的极性液层。参考相关文献[15-18]，本试验考察烷基三甲铵乙酯的HILIC色谱柱(ZIC-HILIC)、结合离子交换作用的HILIC色谱柱(Obelisc R)和键合相为硅胶的HILIC色谱柱(BEH-HILIC)3种色谱柱，并对流动相溶液进行了比较分析。

1.2.3 MSPD条件的优化

实验针对洗脱液分别考察了水、0.1%甲酸以及乙腈等溶液[19-20]，以样品的加标回收率考察提取效果。

1.2.4 仪器条件

色谱条件：Obelisc R柱(2.1 mm×100 mm,5μm)；进样量：3μL；柱温：35℃；流速：0.3 mL/min。洗脱程序见表1，其中流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为乙腈。

表1 流动相梯度洗脱程序

质谱条件：选用ESI+电离模式，离子源电压为4 200 V，离子源温度为380℃，扫描模式为多反应离子监测模式(MRM)，其他质谱检测参数见表2。

表2 5种AGs质谱检测的参数

1.2.5 方法学验证

配制成不同浓度的混合标准系列，在上述设定的实验条件下，进行标准曲线的制作、稳定性与重复性实验和加标回收实验。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

比较ZIC-HILIC柱、Obelisc R柱以及BEH-HILIC柱发现，ZIC-HILIC柱和ObliscR柱对5种AGS组分的分离效果较好，其中ZIC-HILIC柱在流动相为乙腈：150 mmol/L乙酸铵-1.0%甲酸(20∶40∶40v/v/v)，条件下5种目标物的响应值最高；使用Obelisc R柱时，采用0.1%甲酸-乙腈作为流动相，梯度洗脱的模式下，也可以实现氨基糖苷类药物的分离。

在上述两种色谱柱优化的条件下，分别比较两种色谱柱的混合标准物质MRM图，如图1所示。从图1可以看出，链霉素和双氢链霉素在色谱图上均不能很好的分离，但可以通过质谱分析中不同离子对进行区分，其中使用Obelisc R柱分析时各组分的灵敏度优于ZIC柱。

图1 5种AGs在两种色谱柱中的MRM图

2.2 基质固相分散条件优化

结果如图2所示，洗脱液为甲酸溶液时，5种AGs组分回收率最高，其次为水，效果最差的为乙腈，主要是由于5种化合物组分为碱性物质，洗脱液为酸性时目标组分容易被洗脱。甲酸溶液作为洗脱液时，进一步优化最佳浓度，结果如图3所示。从图中可以看出，当甲酸溶液浓度选择0.1%时，各个组分的AGs回收率均较好（回收率达到77.2%～93.6%），进一步增加甲酸溶液浓度，5种AGs回收率反而会下降。

图2 3种洗脱液对回收率的影响

图3 洗脱液浓度对回收率的影响

2.3 基质效应的影响

乳制品样品中的干扰基质较多，如磷脂、蛋白质、脂肪等，为了减少此类物质对质谱检测器产生基质干扰，本试验前处理采用乙腈、乙腈-甲酸混合溶液淋洗掉样品中的干扰物，并优化淋洗液中甲酸溶液的比例。结果发现，依次以2 mL乙腈、2 mL乙腈-1.0%甲酸（95∶5，v/v）、2 mL乙腈-1.0%甲酸（90∶10，v/v）、2 mL乙腈-1.0%甲酸（85∶15，v/v）的步骤来淋洗效果最佳，淋洗好后以2 mL0.1%甲酸溶液洗脱得到洗脱液。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线的制作

如表3所示，5种AGs线性关系良好，相关系数（R2）在0.9991～0.9999之间，方法的检出限为2.5～25μg/kg，定量限为8.0～80μg/kg。

表3 5种AGs的线性范围、标准曲线、相关系数、检出限与定量限

2.4.2 稳定性与重复性

在最优条件下，对双氢链霉素和卡那霉素30 ng/mL，大观霉素60 ng/mL，链霉素和阿米卡星300 ng/mL的混合标准溶液进行HILIC分析，每天测定3次，连续一周。结果表明，5种化合物组分的测得结果日内相对标准偏差为3.0%~3.6%，日间相对标准偏差为3.3%~8.7%，说明该方法的稳定性和重复性均良好。

2.4.3 加标回收实验

分别添加2倍定限量、5倍定限量和10倍定限量低、中、高的3个水平混合标准品溶液（大观霉素加标量32、80、160μg/kg；链霉素和阿米卡星加标量160、400、800 μg/kg、双氢链霉素和卡那霉素浓度加标量16、40、80μg/kg），测定并计算加标加收率。结果如表4所示，5种化合物组分的AGs平均加标回收率范围在80.5%～94.3%，相对标准偏差(RSD)在2.4%～7.1%，满足实验要求。

表4 方法的回收率及相对标准偏差(n=5)

2.5 实际样品的检测

将本方法应用于从超市中随机抽取的5种品牌共40份乳制品样品，检测5种AGs目标组分。。结果显示5种AGs残留含量均低于50μg/kg，满足国家标准限量要求。

3 结 论

本文建立的基质固相分散-亲水交互作用色谱-串联质谱法测定乳制品中5种AGs残留的分析方法，在对色谱的条件、基质固相分散条件、基质效应等因素进行优化后，5种AGs能在2~2 000 ng/mL范围内具有良好的线性关系，5种组分的检出限范围为2.5～25μg/kg，定量限范围为8.0～80μg/kg，加标回收率在80.5%～94.3%。所建立的方法有效解决了检测氨基糖苷类抗生素时反相色谱柱上保留性能不佳、回收率低的分析难点，可为乳制品中5种AGs残留的分析和监控提供技术支持。