乳酸菌与酵母菌混菌发酵新型乳制品的研究

陈毅坚，张建前，胡秋月，杨发涛，吕吉升，杜刚

（云南民族大学民族医药学院，昆明650500）

0 引 言

乳酸菌是乳杆菌属、乳球菌属等革兰氏阳性菌的统称[1-2]。它们在维持机体的生态平衡、调节免疫等生理机能方面有重要调节作用[3-4]。

现已有酵母菌参与发酵乳共发酵，乳酸菌与酵母菌共生机制的研究报告[5-6]，但乳酸菌和食用酵母菌混菌发酵乳品风味物质的研究报道较少。风味物质是区别不同食品质量特征的指标之一[7]。不同乳制品中的乳酸、芳香类风味物质赋予乳制品独特的风味[8]。乳制品研究主要集中于发酵条件[9]、发酵剂的使用[10]、色素使用[11]等方面，开展乳酸菌与食用酵母菌混菌发酵的乳制品中挥发性风味物质的研究，分析两种益生菌混菌发酵与乳酸菌单菌发酵乳制品在风味物质上的区别，为不同益生菌混菌发酵型乳制品的风味物质变化提供基础研究资料。

1 实 验

1.1 材料和试剂

（1）乳酸菌来源于市售7种酸奶，酵母菌来源于1种自酿甜米酒。

（2）分离培养基和分子实验材料。乳酸细菌培养基（MRS）用于分离酸奶样品中的乳酸菌（MRS固体培养基）和增菌培养（MRS液体培养基），马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）用于甜米酒样品中酵母菌的分离(PDA固体培养基）和增菌培养(PDA液体培养基），酵母浸出粉葡萄糖培养基（YPD液体培养基）用于提取DNA的乳酸菌和酵母菌菌体的培养Q 5超保真DNA聚合酶（纽英伦生物技术北京有限公司），TE缓冲液，1×CTAB缓冲液，1×TAE缓冲液。

乳酸菌的PCR扩增引物为16SP1和16SP2[12]，酵母菌的PCR扩增引物为26S NL1和26S NL4[13]，4种引物均合成于昆明硕擎生物技术有限公司。

表1 PCR扩增的引物序列

1.2 仪器

高压蒸气灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超净工作台，苏净集团安泰公司；离心机，湖南湘立科学有限公司；恒温干燥培养箱，广东省医疗器械厂；恒温摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司；电子天平，上海奕宇电子科技有限公司；光学显微镜，宁波舜宇仪器有限公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；EN 61326-PCR仪，北京泰克仪器有限公司；WD-9413B凝胶成像分析仪，北京六一生物科技有限公司；75μm CAR/PDMS萃取纤维头，美国Supelco公司；气相色谱-质谱联用仪（DB-FFAP石英毛细柱），美国Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌与酵母菌的分离纯化及鉴定

1.3.1.1 乳酸菌与酵母菌的分离纯化

采用样品稀释梯度涂布平板方法，将7种酸奶样品和1种甜米酒样品的10-2、10-3、10-44个梯度稀释液分别涂布于事先备好的MRS、PDA平板上，酸奶样品涂布的MRS固体平板培养基，置于37℃的恒温培养箱中进行培养；自酿甜米酒样品涂布的PDA固体培养基，置于28℃的恒温培养箱中培养；定期观察菌落的生长状况，并挑选符合乳酸菌和酵母菌菌落特征的菌株进行纯化，获得的疑似乳酸菌用MRS液体培养基增菌培养，疑似酵母菌用PDA液体培养基增菌培养。之后将获得的菌株保藏于4℃的低温环境中。

1.3.1.2 乳酸菌与酵母菌的形态学观察

将获得的平板培养物进行形态特征的观察，并记录特征。对酸奶样品中分离纯化得到的菌株革兰氏染色，镜检记录细胞显微结构和染色情况；甜米酒样品中分离得到的菌株，用2%的伊红染液染色，镜检细胞显微结构和细胞的染色情况。

1.3.1.3 乳酸菌与酵母菌的分子鉴定

（1）乳酸菌和酵母菌DNA的提取。将分离纯化获得的疑似乳酸菌菌株RSJ-1和酵母菌菌株JMJ-1活化好后分别接种于YPD液体培养基中，37℃的恒温培养3~4 d后转入新的YPD液体培养基中继代培养，再取继代培养的菌体分别提取DNA，保藏于-20℃的冰箱中保藏。其中，菌株RSJ-1中的DNA用热裂解法[14]提取，菌株JMJ-1中的DNA用CTAB法提取。

（2）乳酸菌与酵母菌的PCR扩增。以Q 5超高保真DNA聚合酶进行菌株特定序列的PCR扩增，酸奶样品中RSJ-1菌株的扩增引物为16SP1和16S P2；甜米酒样品JMJ-1菌株的扩增引物为26S NL1和26S NL4。PCR的扩增体系和循环条件如表2和表3所示。

表2 PCR的扩增体系

表3 PCR的循环体系

（3）乳酸菌与酵母菌的分子鉴定。菌株RSJ-1和JMJ-1在PCR扩增后，配制0.1%的琼脂凝胶进行PCR扩增产物的电泳仪检测分析，对PCR扩增的产物条带进行琼脂凝胶回收送样测序，测序由昆明硕擎生物技术有限公司代理完成。

1.3.2 乳酸菌与酵母菌混菌发酵乳制品风味物质的研究

（1）样品制作。用上述分离获得的乳酸菌菌株RSJ-1制作单菌发酵乳制品对照样品，同时也用菌株RSJ-1与JMJ-1制作混菌乳制品样品。

（2）样品的预处理。取10 g乳制品对照样品和10 g混菌发酵乳制品样品分别加入20 mL的顶空瓶中，分别加入3 g NaCl和搅拌子，密封顶空瓶瓶口，于40℃的恒温水浴中平衡10 min。将萃取纤维头插入顶空瓶中吸附30 min（萃取纤维头不接触样品），从顶空瓶中拔出萃取头，将其插入气相色谱—质谱联用仪中，启动气相色谱-质谱联用仪检测[15-17]。

（3）单菌发酵乳制品对照样品与混菌发酵乳制品样品的GC/MS测定。①GC/MS的参数条件。气相色谱条件[18-19]：程序升温为初始温度40℃，维持2 min，以5℃/min的速度上升至200℃，继续以10℃/min的速度上升至240℃，维持2 min。进样口温度250℃，传输线温度200℃，以氦气为载气，分流进样，分流比为50∶1，柱流量1 mL/min，总流量为2 mL/min。质谱条件：电离方式EI，电子能量70 eV；离子源温度180℃，质量扫描范围m/z35-500。②数据处理。以参考文献及标准图谱的结果进行核对，得出相应的鉴定结果，对得到的数据进行分类整理，分析出单菌和混菌发酵乳制品中风味物质的变化情况[20-21]。

2 结果和分析

2.1 乳酸菌与酵母菌的分离纯化及鉴定结果

从酸奶样品中共分离得到了6株菌株，分别编号为RSJ-1、RSJ-2、RSJ-3、RSJ-4、RSJ-5、RSJ-6；甜米酒样品中分离得到1株菌株，编号为JMJ-1；经过菌株形态学观察，所获菌株特征符合乳酸菌与酵母菌特征，初步鉴定为乳酸菌和酵母菌。选取乳酸菌菌株RSJ-1和酵母菌菌株JMJ-1用于后续研究，两株菌的形态特征见图1。

图1 分离获得的菌株菌落和细胞形态特征

图1 中，（a）分离自酸奶样品的乳酸菌菌株RSJ-1的菌落形态；（b）乳酸菌菌株RSJ-1细胞形态(16*100×)；(c)分离自甜米酒样品的酵母菌菌株JMJ-1的菌落形态；(d)酵母菌菌株JMJ-1的细胞形态(16*100×)。

2.2 乳酸菌与酵母菌的分子鉴定结果

分离获得的乳酸菌菌株RSJ-1和酵母菌菌株JMJ-1，PCR结果显示RSJ-1菌株的DNA的长度为1401 bp（碱基对），进化树分析的结果显示该菌株归属于乳酸菌属；自酿甜米酒样品中分离得到的JMJ-1菌株的DNA的长度在为585 bp（碱基对），进化树分析的结果显示该菌种归属于酵母菌属。PCR扩增图见图2、图3，分子进化树图见图4、图5。

图2 酸奶样品菌株RSJ-1的PCR扩增凝胶图

图3 自酿甜米酒样品菌株JMJ-1的PCR扩增凝胶图

图4 菌株RSJ-1的基于16SrRNA基因序列的分子进化树

图5 菌株JMJ-1基于26SrRNA基因序列的分子进化树

2.3 乳酸菌与酵母菌混菌发酵乳制品风味物质的测定结果

2.3.1 乳酸菌单菌发酵和乳酸菌与酵母菌混菌发酵乳制品样品制作

采用乳酸菌单菌发酵和乳酸菌与酵母菌混菌发酵制作的乳制品品质特征见表4。

表4 乳酸菌与酵母菌混菌发酵乳制品试验结果

2.3.2 两种样品的GC/MS测定结果

乳酸菌单菌发酵乳制品样品和乳酸菌酵母菌混

菌发酵乳制品样品的GC/MS的检测结果显示，单菌发酵样品中共检测出40种挥发性风味物质，混菌样品中共检测出24种挥发性风味物质。GC/MS测定结果如图6和图7所示。单菌发酵乳制品与混菌发酵乳制品样品的挥发性物质及其相对含量表见表5。

表5 单菌发酵乳制品对照样品与混菌发酵乳制品样品的挥发性物质及其相对含量

图6 单菌发酵对照样品的GC/MS结果

图7 混菌发酵乳制品样品的GC/MS结果

2.3.3 两种样品挥发性成分的分析

单菌发酵对照样品和混菌发酵样品的GC/MS检测结果显示，两种乳制品样品的挥发性成分主要为酸类、醇类、酯类、酮类、醛类和烃类物质。

（1）酸类。单菌发酵对照样品中检测出14种酸类物质，混菌发酵样品中检测出9种酸类物质，两种发酵乳制品样品中都产生了乳酸、辛酸、癸酸、十二酸和十四酸5种酸类物质，其中，单菌对照样品中乳酸的相对含量达到了3.4，远高于混菌发酵乳制品样品中的乳酸含量，乳酸是乳制品产生酸味的主要物质。

（2）醇类。单菌发酵的对照样品中仅产生了3-呋喃甲醇一种醇类物质，而混菌发酵样品中产生了3-甲基丁醇、2，3-丁二醇、2-呋喃甲醇和苯乙醇四种醇类物质，3-呋喃甲醇、3-甲基丁醇和2，3-丁二醇的相对含量都达到了1.1以上，其中的3-甲基丁醇的相对含量达到了5.6，苯乙醇相对含量达到了2.82，说明加入酵母菌促进了发酵乳制品中醇类物质的产生，并极大地提升了3-甲基丁醇含量，是乳制品产生酒香味的主要物质之一。

（3）酯类。两种发酵乳制品样品中共检测出7种酯类物质，单菌发酵样品中检测出6种酯类物质，混菌样品中检测出2种酸类物质，仅有癸酸乙酯为两种乳制品样品都产生的酯类物质，并且7种酯类物质的相对含量都小于1，酯类的产量较低。

（4）酮类。单菌发酵对照样品中检测出6种酮类物质，混菌发酵样品中检测出3种酮类物质，两种样品产生不同的酮类物质，且酮类物质的相对含量都小于1，酮类的产量较低。

（5）醛类。两种发酵乳制品样品中共检测出7种醛类物质，单菌发酵对照样品中检测出7种醛类物质，混菌样品中检测出其中的3种醛类物质，两种发酵乳制品样品中5-羟甲基糠醛的相对含量都大于1，相对含量较高，混菌发酵样品中的5-羟甲基糠醛含量约为单菌发酵对照样品中的3倍。

（续表5）

（6）烃类。单菌发酵对照样品中检测出6种烃类物质，混菌发酵样品中检测出3种烃类物质，其中的2，2-对二苯酚丙烷在两种发酵乳制品样品中相对含量大于1，单菌发酵对照样品中2，2-对二苯酚丙烷的含量约为混菌发酵样品中的3倍。

3 结 论

本研究用乳酸菌单菌发酵乳制品和乳酸菌酵母菌的混菌发酵乳制品试验比较可看出，两种方式产生的风味物质均较多，均含有酸类、醇类、酯类、酮类、醛类、烃类，加入酵母菌的混菌发酵可降低产酸量，增加醇类风味成分物质如苯乙醇、3-甲基丁醇的含量，产生种类较多的酯类，形成含量较高的5-羟甲基糠醛，2，2-对二苯酚丙烷等醛类，烃类风味物质，研究结果可为采用不同益生菌混菌发酵加工乳制品的方法提供借鉴。