铜离子吸附假单胞菌MEW079 筛选鉴定及其发酵条件优化

向圣萍，邵闯，王慧敏1,*

（1.江汉大学持久性有毒污染物环境与健康危害湖北省重点实验室，湖北武汉430056；2.湖北省城市矿产资源循环利用工程技术研究中心,湖北荆门 448000；3.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉430064）

重金属污染由于其毒性、非生物降解性和普遍性等特点，是目前最重要的环境问题之一。重金属可以通过工业废水和废渣等方式进入空气和土壤，造成严重的环境污染问题，威胁着人类的健康和生态系统[1]。重金属种类主要包含有3 种：有毒金属（Cr、Cu、Zn、Hg、Ni、Cd、Pb、Co、Sn 等）、贵金属（Pd、Ag、Au、Pt、Ru 等）以及放射性核素（U、Th、Ra、Am 等）[2]。其中，铜离子普遍存在于电镀、采矿和金属加工等各种工业废水中，很难从水体中去除，最终可以通过食物链积累到人体中[3]。目前，从水溶液中去除重金属的方法主要有化学沉淀法、化学氧化法、离子交换法、蒸发法、电镀法和膜处理法等[4]。然而，这些方法可能会产生二次有毒化学污泥，或者效率低、价格昂贵，尤其是在低浓度的情况下。生物吸附法处理污水中重金属污染，因具有效率高、成本低等优点而受到人们的广泛关注[5]。

目前，多种生物吸附剂已被用于去除和回收水溶液中的金属离子，包括细菌、真菌、酵母、藻类，甚至植物[6]。其中，芽孢杆菌属（Bacillus subtilis）[7]、微杆亚铁氧化菌属（Microbacterium sp.）[8]和假单胞菌属（Pseudomonas putida）[9]等多种细菌都具有较强的铜离子生物吸附能力。由于假单胞菌具有易培养、较强的环境适应性以及铜离子吸附能力强等优良性能，因此筛选和开发新的假单胞菌吸附剂并在重金属污染修复中运用具有重要的应用价值。

本文通过梯度驯化和富集培养从重金属污水中筛选吸附铜离子的菌株，并通过单因素实验、最陡爬坡路径试验和Box-Behnken 响应面实验优化菌株的发酵培养条件，使得菌株对铜离子溶液表现出高效的吸附性能。

1 材料与方法

1.1 材料

供试重金属污水采集于荆门市城南污水处理有限公司。

1.2 设备与试剂

HZQ-Q 型恒温摇床培养箱，哈尔滨东胜电子技术开发有限公司；722 型可见光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；HPP9052 型电热恒温培养箱，北京东联哈尔仪器制造有限公司；CR21GM 型超速冷冻离心机，日立Hitachi；FA1104 型电子天平，上海浦春计量仪器有限公司；JBM-7100F 型场发射扫描电镜，日本电子株式会社（JEOL）捷欧路；ICAP7200 型电感耦合等离子光谱发生仪，赛默飞Thermo。

葡萄糖、蔗糖、硫酸铵、氯化铵、硫酸铜、NaCl、Na2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O，分析纯，采购于中国国药化学集团化学试剂有限公司；麦芽糖、乳糖、淀粉、尿素，分析纯，采购于中国阿拉丁试剂（上海）有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、玉米浆为试剂级，豆粕、牛肉膏为生物试剂级，采购于上海麦克林生化科技有限公司。

1.3 重金属污水中铜离子吸附细菌筛选鉴定及表征

1.3.1 铜离子吸附细菌的筛选

取160 mL供试重金属污水放入灭菌的锥形瓶中，加入20 mL 灭菌的LB 培养基（胰蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.0）和20 mL 400 mg/L 灭菌的硫酸铜溶液。28 ℃、150 r/min 条件下培养5 d 后，取出40 mL 培养液，再次加入20 mL灭菌的LB 培养基和20 mL 400 mg/L 灭菌的硫酸铜溶液，如此循环5 次。最后，取出培养液，采用平板稀释法涂布在100 mg/L 的LB 固体培养基平板上，筛选单菌落。

1.3.2 铜离子吸附细菌的鉴定

将铜离子吸附细菌单菌落挑取至LB 培养基于28 ℃、150 r/min 条件下过夜活化。在LB 平板上划线，28 ℃倒置培养3 d 后，观察细菌菌落形态。革兰氏染色、扫描电子电镜（SEM）观察和16SrDNA 鉴定方法参考Sun 等[10]方法进行。

1.3.3 菌株生长曲线绘制

将菌株过夜活化后，按照接种量4.0%接种到发酵初始培养基（葡萄糖20.00 g，胰蛋白胨20.00 g，Na2SO44.00 g，K2HPO41.00 g，MgSO4·7H2O 1.00 g，pH 7.0），在28 ℃、150 r/min 条件下，测定不同培养时间OD600并绘制生长曲线。

1.3.4 菌株铜离子吸附能力测定

将菌株发酵液于8 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集菌体。使用无菌生理盐水洗涤2 次并重悬，调整菌悬液OD600=1.0。再次离心，使用100 mg/L 硫酸铜溶液重悬。28 ℃、150 r/min 处理2 h 后，8 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集上清液。上清过滤除菌后，使用电感耦合等离子光谱发生仪检测溶液中铜离子浓度，采用以下公式计算铜离子去除率。

式（1）中，A表示铜离子去除率，%；C0表示初始溶液中铜离子初始浓度，mg/L；Ct表示菌株处理后溶液铜离子浓度，mg/L。

1.3.5 菌株发酵条件优化

单因素实验：分别使用不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和淀粉）和不同氮源（胰蛋白胨、酵母粉、玉米浆、牛肉膏、尿素、硫酸铵、氯化铵和豆粕），对发酵初始培养基进行单一成分改变。菌株接种到1 L发酵培养基后，28 ℃、150 r/min 培养20 h 后，测定铜离子吸附能力。

参考文献[11]，以菌浓度OD600=1.0 时，菌株对100 mg/L 铜离子溶液的吸附率为指标，进行最陡爬坡路径试验和Box-Behnken 响应面实验，并使用SAS 9.2软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 铜离子吸附菌株的筛选与鉴定

通过铜离子梯度驯化富集培养和平板梯度稀释涂布法，从重金属污水中筛选到一株菌株，命名为MEW079。MEM079 菌株在LB 固体培养基上28℃培养24 h 后，菌落形态为菌落隆起、白色不透明、边缘整齐，革兰氏染色显示为阴性。将MEM079 菌株在LB 液体培养基中培养24 h 后，SEM 观察如图1A 所示。SEM 图显示MEM079 菌为杆状，尺寸为（0.3～0.6）μm×（1.0～2.5）μm。对MEW079 菌株进行了16S rDNA 测序，序列已提交至NCBI，登录号为KY462186。序列经过Ezbiocloud[12]比对后，使用MEGA6.0 软件对具有较高序列相似度的典型菌株进行聚类分析，构建了16S rDNA 系统发育树，结果如图1B 所示：MEW079 菌株16SrDNA 与Pseudomonas asiaticaRYU5 和Pseudomonas taiwanensisBCRC 17751的16S rDNA 序列相似性最高，均达到了99.65%。结合细胞形态和16S rDNA 多序列比对分析，将MEW079 菌株归属为Pseudomonas sp.。

图1 MEW079 菌株鉴定结果

2.2 MEW079 菌株的生长曲线测定

如图2 所示，MEW079 生长曲线可被划分为以下4 个时期：0～2 h 适应期；2～16 h 对数生长期；16～26 h 稳定期；26 h 后进入衰亡期。据此，选取20 h 为后续发酵条件优化的培养时间。

图2 MEW079 菌株生长曲线测定

2.3 单因素实验

如图3 所示，发酵初始培养基培养后，MEW079菌株对铜离子溶液吸附率为68.18%±1.13%。在碳源方面，蔗糖促进MEW079 菌株对铜离子吸附能力最强，吸附率为83.78%±4.61%。因此，选取蔗糖为最适碳源进行下一步发酵条件优化。在氮源方面，尿素促进MEW079 菌株对铜离子吸附能力最强，为87.55%±1.51%；其次为酵母粉，对铜离子吸附率为82.12%±1.43%。由于尿素为单一氮源时，菌株生长活性较弱，加入酵母粉后可以改善此问题，因此选择尿素和酵母粉作为氮源进行下一步发酵条件优化。

图3 不同碳源和氮源培养后对MEW079 吸附铜离子能力的影响

2.4 最陡爬坡路径试验

如表1 所示，MEW079 菌株培养后，在菌浓度OD600=1.0 时，对100 mg/L 铜离子溶液的吸附率随着蔗糖、酵母粉和尿素的添加量的增加先增加后下降。当蔗糖浓度为21.0 g/L、酵母粉为9.5 g/L 和尿素为10.5 g/L 时，MEW079 菌株对铜离子的吸附率最高，达到了95.07%。因此，选择此条件为响应面BOXBehnken 试验设计的中心点。

表1 MEW079 菌株最陡爬坡路径试验设计结果

2.5 Box-Behnken 响应面实验

使用SAS 9.2 软件对最陡爬坡路径试验的最优组进行进一步的二阶优化。如表2 所示，根据Box-Behnken 设计，给出了变量的水平、实验设计和回归分析结果。

将以上数据绘制响应面图，探讨自变量与响应值之间的关系和相互作用。如图4 所示，由于响应面图呈现立体图向下指向，因此在选定的范围内存在极值，即响应值的最高点。预测模型为：Y=-445.35+25.13X1+11.71X2+42.41X3-0.79X12+0.25X1X2+0.56X1X3-1.30X22+0.70X2X3-2.89X32。对方程两边求导，可得三元一次方程组（1）。

表2 响应面Box-Behnken 试验设计优化结果

对方程组求解，得到X1=21.11，X2=9.37，X3=10.52。为了验证预测结果，在最佳发酵条件下进行了验证实验。获得的吸附率为95.87%，较68.18%的初始发酵条件下吸附率提高了27.69 个百分点。因此，MEW079 的优化发酵培养条件如下：蔗糖21.11 g、酵母粉9.37 g、尿素10.52 g、Na2SO44.00 g、K2HPO41.00 g、MgSO4·7H2O 1.00 g，pH 7.0，接种量 4.0%，培养温度28℃，转速150 r/min。

图4 MEW079 菌株Box-Behnken 法响应面图

3 结论

本研究经过梯度驯化富集培养后从重金属污水中筛选到一株吸附铜离子的假单胞菌MEW079。蔗糖、尿素和酵母粉可以促进MEW079 菌株对铜离子的吸附。采用最陡爬坡路径试验和Box-Behnken 响应面实验优化了发酵培养条件，明显提高了MEW079菌株对铜离子的吸附能力，最佳发酵条件为蔗糖21.11 g、酵母粉9.37 g、尿素10.52 g、Na2SO44.00 g、K2HPO41.00 g、MgSO4·7H2O 1.00 g，pH 7.0，接种量4.0%，培养温度28 ℃，转速150 r/min。未来还需寻找合适的菌株固定化方法以实现其在工业上处理重金属污水中的应用。