甲壳动物过氧化物还原酶基因的研究进展

李辉，冯伟，于俊杰，张明胤，周春妙，唐永凯,3*

（1.水产科学国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村部淡水渔业与种质资源利用重点实验室，江苏 无锡 214081；3.南京农业大学无锡渔业学院，江苏 无锡 214128）

生物代谢在有氧条件下会产生一种副产物——活性氧（reactive oxygen species,ROS），其主要包括过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子自由基（·O－2）、羟基自由基（·OH）、臭氧（O3）和一氧化氮（NO）等[1-2]。低浓度的活性氧可促进细胞有丝分裂、增殖和分化，参与细胞内信号转导过程，并进一步调节多种生物学活动，如宿主防御、抑制细菌和病毒产生等。高浓度活性氧会破坏生物膜、核酸和蛋白质等，从而引起细胞凋亡和损伤[3-7]。当ROS 的产生超出其清除能力时，就会出现所谓的“氧化应激状态”[8]。生物在进化过程中，逐渐形成各种高效和准确的抗氧化系统，以此来抵御高浓度ROS 造成的损伤，主要包括过氧化氢酶（catalase, CAT）、硫氧还原蛋白（thioredoxin, TRX）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和过氧化物还原酶（peroxiredoxin,Prx）等[9]。在正常生理状态下，ROS 和抗氧化酶呈现出一种动态平衡状态。在无脊椎动物中，氧化还原平衡是疾病与生理学变化相互作用的结果，是先天性免疫不可缺少的部分[10]。外界生物和非生物胁迫诱导体内产生并积累大量的ROS，氧化还原平衡就会被打破，这些抗氧化酶的表达量会增加以抵御ROS带来的危害[11]。

过氧化物还原酶（Prx）属于进化保守的抗氧化分子家族，在清除过氧化物、传导信号等方面发挥着重要作用，一直受到研究者的关注。近年来，Prx基因在细菌、真菌、哺乳动物、植物中相继被发现，同时，在甲壳动物中也逐渐被发现。为丰富甲壳动物Prx基因的研究数据，深入了解Prx基因在甲壳动物中的免疫防御机制，本文就近年来Prx基因在甲壳动物中的研究进行了综述，旨在为以后更好地研究甲壳动物Prx基因的生物学功能提供参考。

1 Prx 概述

Prx属于抗氧化蛋白超家族，通过硫氧还蛋白作为氢供体来消除氢过氧化物，有效调节体内ROS水平，起到抗氧化作用[12-13]。在酿酒酵母中首次发现了Prx蛋白，分子质量约为25 kDa。后续研究发现，该蛋白广泛存在于动植物中，如小麦（Triticum aestivumL.）[14]、发状念珠藻（Nostoc flagelliforme）[15]、七鳃鳗（Lampetra japonicum）[16]、小鼠（Mus musculus）[17]、褶纹冠蚌（Cristaria plicata）[18]等。Prx主要定位在细胞质和线粒体中，同时，细胞质和线粒体也是细胞中ROS的主要产生部位，因此，Prx被认为在防止ROS 引起的氧化损伤中起重要作用[19-20]。

在哺乳动物中，相关研究已经鉴定了6 种不同的Prx 亚型，包括Prx1、Prx2、Prx3、Prx4、Prx5 和Prx6[13]。根据在清除ROS反应中起催化作用的半胱氨酸（cysteine,Cys）残基的数目和位置，Prx 可分为3 个亚家族：典型2-Cys Prx、非典型2-Cys Prx 和1-Cys Prx[21]。Prx1～Prx4 属于典型2-Cys Prx 亚家族，且这4个亚型的N端和C端各含有1个保守的半胱氨酸（Cys）残基。Prx5 的N 端和C 端也各含有1个保守的Cys 残基，但是C 端的Cys 残基保守性较低，属于非典型2-Cys Prx 亚家族；Prx6 属于1-Cys Prx亚家族，其仅在N端含有1个保守的Cys残基[22]。通过比对这6 个成员的同源性发现，Prx1～Prx4 之间具有较高的同源性，Prx6 与Prx1～Prx4 之间的同源性为40%，而Prx5 和Prx1～Prx4 的同源性仅为10%[23]。

植物中的Prx 可分为4 类：1-Cys Prx、2-Cys Prx、PrxⅡ和PrxQ。PrxⅡ类成员较多，包含PrxⅡA、PrxⅡB、PrxⅡC、PrxⅡD、PrxⅡE 和PrxⅡF[24]。其中，植物中只有1-Cys Prx 包含1 个保守的Cys 残基，其他类别均包含2个保守的Cys残基。这些Prx大多可以在哺乳动物中被发现，但PrxQ只存在于低等真核生物和细菌中。同时，根据序列同源性和结构相似性，Prx又可分为6个亚家族（表1）。

大多数Prx 都是膜内蛋白酶，只有Prx4 可以依靠其典型的N 端分泌性信号肽分泌至细胞膜外来发挥功能。哺乳动物的Prxl、Prx2 和Prx6 主要定位于细胞质中[24-25]，Prx3定位于线粒体上，Prx4定位于内质网和细胞外间隙中[26]，Prx5 定位于过氧化物酶体中[27-28]。Prx 家族位置的分布同时也决定了其特定的功能。

1.1 典型2-Cys Prx

典型2-Cys Prx为Prx家族中最大的一类，在肽链N端和C端Cys残基周围的序列都具有高度的保守性[29]，其N端的保守序列是“FYPLDFTFVCPTE”，C端的保守序列是“GEVCPA”。在发挥抗氧化作用的过程中，首先，典型2-Cys Prx 的N 端Cys 残基被氧化成次磺酸基团（Cys-SOH）[30]，然后，该基团与另一个C 端Cys 残基发生反应，通过二硫键形成首尾连接的同源二聚体[31]，最后，形成的二硫键被硫氧还蛋白还原，典型2-Cys Prx重新恢复活性。

表1 基于序列同源性和结构相似性的Prx分类Table 1 Prx classification based on sequence homology and structural similarity

1.2 非典型2-Cys Prx

作为Prx 家族最后被发现和研究的一个亚型，Prx5肽链N端和C端的Cys残基周围也具有保守序列，其中N端的保守序列是“VPGAFTPGCSKTHLP G”，C 端的保守序列是“DGTGLTCSL”。非典型2-Cys Prx 的反应机制与典型2-Cys Prx 具有相似之处，其N 端保守的Cys 残基也被氧化成次磺酸基团（Cys-SOH），不同的是，生成的次磺酸基团（Cys-SOH）将会与自身C 端的Cys 残基形成分子内二硫键[32]。

1.3 1-Cys Prx

Prx6 的N 端保守序列为“PVCTTE”，其初始部分的反应机制与典型2-Cys Prx和非典型2-Cys Prx相同，都是N 端保守的Cys 残基被氧化成次磺酸基团（Cys-SOH），不同之处在于，由于附近没有可以参与反应的Cys残基，故无法形成二硫键。因此，需要依赖其他（非硫氧还蛋白）作为氢供体将次磺酸还原为初始状态。有报道还发现，在π型谷胱甘肽S-转移酶（πglutathioneS-transferase,πGST）的介导下，Prx6 与谷胱甘肽（glutathione, GSH）形成二硫键，并重新恢复活性[33]。

2 甲壳动物的Prx 基因

在甲壳动物中，TU等[34]首次系统化地对拟穴青蟹（Scylla paramamosain）Prx基因进行了分析。与哺乳动物略有不同的是，甲壳动物Prx 亚型分为Prx1/2、Prx3、Prx4、Prx5和Prx6。拟穴青蟹Prx1/2比对结果符合典型2-Cys Prx 的结构特征，但在系统进化树中，却是和其他具有密切遗传关系的甲壳动物Prx 先聚为一个新支后，再与Prx1～Prx4 聚集。因此，伴随着这种情况的Prx基因被命名为Prx1/2，无脊椎动物中的Prx1/2基因被推测是Prx1和Prx2的祖先基因，即未分化的Prx基因。卜瑞倩[35]在对斑节对虾（Penaeus monodon）的研究中发现了1 个PmPrxn基因，多重序列比对分析显示，PmPrxn的保守性很低，与印度明对虾（Fenneropenaeus indicus）和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）PmPrxn 的同源性分别为45%和44%；且系统进化树显示，PmPrxn 单独为一支，不与Prxl～Prx4 聚集，属于典型2-Cys Prx。这表明PmPrxn 是从Prx 超家族中新发现的2-Cys Prx的成员。

2.1 甲壳动物Prx 家族基因序列特征

目前，国内外的一些研究得到了多种甲壳动物Prx基因的全长序列，但许多研究只发现了Prx基因中的一种或几种亚型。表2 显示了NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中甲壳动物Prx基因的开放阅读框及其编码的氨基酸长度。从中可知，大部分的甲壳动物都只是研究了Prx基因，即未分化的基因，而对于其他亚型的研究较少。同时还发现，不同甲壳动物各自Prx、Prx4和Prx6基因的开放阅读框及其编码的氨基酸长度相同，而各自Prx3和Prx5基因的开放阅读框及其编码的氨基酸长度略有不同。其中：拟穴青蟹Prx3基因的开放阅读框最长，为690 bp，中华绒螯蟹和日本对虾Prx3基因的开放阅读框长度相同，为681 bp；脊尾白虾Prx5基因的开放阅读框最长，为585 bp，而斑节对虾与中华绒螯蟹的分别为570和552 bp。

2.2 甲壳动物Prx 的生物学分析

通过在线软件ExPASy（http://www.expasy.org/proteomics）对表2 中甲壳动物Prx 家族的氨基酸序列进行生物学分析，结果发现，甲壳动物Prx家族蛋白质在进化过程中较为或者高度保守。在亲疏水性方面，Prx、Prx4 和Prx6 都是亲水性蛋白；日本对虾的Prx3和中华绒螯蟹的Prx5是亲水性蛋白，其余甲壳动物的Prx3 和Prx5 都是疏水性蛋白。信号肽预测结果显示，只有Prx4 含有信号肽，其他均无信号肽，该结果与在哺乳动物中发现的一致。跨膜结构分析表明，只有Prx4 具跨膜结构域，其余均无。此外，亚细胞定位分析结果（表3）表明，Prx 和Prx6定位在细胞质中的概率较大，Prx3 定位于线粒体上，Prx4 有较大概率定位于线粒体中，Prx5 定位于过氧化物酶体上。以上所述的这些结果与章波等[13]的研究结果一致。

表2 甲壳动物Prx基因及其编码的氨基酸序列Table 2 Prx genes and their coding amino acid sequences of crustacean

2.3 甲壳动物Prx 系统进化分析

从NCBI 中筛选出几种哺乳动物Prx亚型基因的氨基酸序列，分别为人（Homo sapiens）的Prx1（NP_001189360.1）、Prx2（NP_005800.3）、Prx3（AAI13724.1） 、 Prx4 （NP_006397.1） 、 Prx5（AAI13724.1）和Prx6（NP_004896.1）；家鼠（Mus musculus） 的 Prx2 （NP_001304314.1） 、 Prx3（EDL01849.1）和Prx4（AAH19578.1）；褐家鼠（Rattus norvegicus）的Prx1（AAH88118.1）、Prx2（AAH58481.1） 、 Prx3 （EDL94585.1） 、 Prx4（AAH59122.1）和Prx6（NP_446028.1）；牛（Bos taurus）的Prx1（NP_776856.1）和Prx5（AAG53661.1）；原鸡（Gallus gallus）的Prx6（NP_001034418.1）。利用邻接法，对上述哺乳动物的Prx蛋白序列与表2中已知

的部分甲壳动物Prx 蛋白序列构建系统进化树（图1），分析发现：中华绒螯蟹Prx3与拟穴青蟹Prx3首先聚在一起，然后再与人Prx3、家鼠Prx3和褐家鼠Prx3聚为一支，甲壳动物Prx4、Prx5和Prx6亦是如此；中华绒螯蟹Prx4与拟穴青蟹Prx4先聚在一起，再与人Prx4、家鼠Prx4和褐家鼠Prx4聚为一支；中华绒螯蟹Prx5、拟穴青蟹Prx5和脊尾白虾Prx5先聚在一起，再与人Prx5和牛Prx5聚为一支；中华绒螯蟹Prx6和拟穴青蟹Prx6先聚在一起，再与原鸡Prx6、人Prx6和褐家鼠Prx6聚为一支；甲壳动物的Prx则不与哺乳动物的Prx1和Prx2聚在一起，而是形成了一个新的典型2-Cys Prx分支。这与TU等[34]的研究结果相同。

表3 亚细胞定位分析Table 3 Subcellular localization analysis

图1 基于9种动物Prx基因蛋白序列构建的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on the protein sequences of Prx genes in nine animals

2.4 甲壳动物Prx 在不同组织中的表达分析

Prx于不同组织中广泛表达，推测Prx可能介入细胞代谢的多种生理功能；然而，其在不同组织中的表达水平不同，这证明它们具有组织偏好性，通常在免疫、发育组织中的表达量相对较高。在体液免疫和基础代谢中，甲壳动物的肝胰腺发挥着重要的作用，在功能上与哺乳动物的肝脏和胰脏类似[36]。多数与免疫相关的基因在肝胰腺中都有较高的表达量[37]。卜瑞倩[35]发现，PmPrx1在斑节对虾鳃、肌肉、肠和脑中具有较高的表达水平，这意味着PmPrx1的表达具有组织偏好性。PmPrx5在肌肉中的表达量最高，其次是在胃、心脏和鳃中，这意味着PmPrx5在调节氧化还原平衡的过程中，可预防ROS 过度积累对组织产生的氧化损伤。ZHANG等[38-39]研究发现，中国对虾Prx在卵巢、肠和肝胰腺中高表达，Prx4在性腺和肝胰腺中的表达量较高。中华绒螯蟹中EsPrx、EsPrx3、EsPrx4和EsPrx5在血细胞、心脏和肠道中的表达量都相对较低，而在肝胰腺中表达量均最高[40]。中华绒螯蟹血细胞在细胞免疫中发挥着重要作用，然而上述4种EsPrx基因在血细胞中低表达，推测健康的中华绒螯蟹在没有受到刺激的情况下，体内免疫和ROS都处于相对平衡的状态。TU等[34]研究发现，拟穴青蟹6种SpPrxs基因的表达模式有明显差异：SpPrx3在肝胰腺、肌肉和心脏等能量消耗较高的器官中的表达量较高，说明SpPrx3可能与线粒体活性氧稳态紧密相关。SpPrx1/2在肝胰腺、鳃、肌肉和肠道中均有较高的表达量。SpPrx4在肝胰腺中高表达。SpPrx6在血细胞中高度表达，与中华绒螯蟹Prx6的表达水平相似[41]，表明SpPrx6可能主要在血细胞中起作用。此外，SpPrx5-1在心脏、鳃、肝胰腺、肌肉和肠道中都有一定量的高表达，而SpPrx5-2在这些组织中的表达量极低。

综上所述，甲壳动物Prx1/2、Prx2、Prx3、Prx4、Prx5、Prx6在组织中广泛表达，且在肝胰腺中均具有较高的表达量，从侧面也印证了肝胰腺在甲壳动物中的重要免疫作用。

3 Prx 的生物学功能

Prx家族蛋白在清除自由基与抗氧化活性方面发挥着至关重要的作用。在氧化应激状态下，Prx家族基因表达量显著上调，以清除细胞胁迫下产生的过多活性氧，保护机体免受活性氧损伤。同时，Prx 也参与细胞信号转导。研究表明，过氧化氢（H2O2）作为细胞内的信号分子，使信号通路中的蛋白质活化或失活，可作为细胞内的二级信使。过氧化物还原酶可以调整体内H2O2浓度，因此，过氧化物还原酶可以间接地调节细胞内的信号传递[42-44]。过氧化物还原酶具有提高自然杀伤细胞活性的能力，并在机体免疫应答过程中发挥重要作用[45]。过氧化物还原酶Ⅰ型和Ⅱ型在哺乳动物中又被称为自然杀伤细胞增强因子A 和B。Prx 通过细胞表面受体介导细胞信号转导途径，减轻氧化应激引起的危害，可用于疾病的治疗。基于该家族过氧化物酶活性，Prx 在肿瘤的治疗中可能具有遏制肿瘤细胞生长的功能[46-47]。

3.1 细菌及病毒感染下甲壳动物Prx的生物学功能

谢亚凯[48]在日本囊对虾中发现，鳗弧菌感染引起的H2O2可以诱导MjPrx6的表达上调，MjPrx6通过发挥谷胱甘肽过氧化物酶活性调节对虾体内H2O2水平，维持对虾体内的氧化还原稳态，防止H2O2过度积累。在嗜水气单胞菌感染情况下，中华绒螯蟹中的EsPrx、EsPrx3、EsPrx4和EsPrx5基因的表达量均显著上升，表明嗜水气单胞菌在中华绒螯蟹体内诱导产生大量ROS，这就需要大量的抗氧化酶来抵御ROS过度积累带来的危害。感染24 h后，EsPrx3和EsPrx5的表达量分别提高了16 倍和15倍，而EsPrx和EsPrx4则分别提高了5 倍和9 倍[40]。现研究发现，细胞内约90%的ROS在生物氧化磷酸化过程中会返回到线粒体中[47]。

ZHANG 等[38]发现，中国对虾感染白斑综合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）后，FcPrx4在血细胞和肝胰腺中的表达量显著上调。体外制备融合蛋白并经活性分析，FcPrx4可在二硫苏糖醇存在下还原H2O2。DUAN等[23]对脊尾白虾进行人工感染鳗弧菌和WSSV，发现其血细胞和肝胰腺中的EcPrx5表达在早期上调，而后逐渐下降。这表明EcPrx5可能参与了对鳗弧菌和WSSV 的暂时免疫应答，同时，在受到鳗弧菌和WSSV攻击后，EcPrx5在血细胞和肝胰脏中的表达谱有所不同，这可能是因为血细胞和肝胰脏的功能不同。母昌考[41]对中华绒螯蟹进行鳗弧菌刺激，发现在血细胞中EsPrx6的表达量在3～12 h 内持续下降，刺激后12 h 降至最低水平，显著低于对照组，24 h 后又开始上升，表明EsPrx6参与了中华绒鳌蟹感染鳗弧菌的免疫应答过程。CHEN 等[49]对三疣梭子蟹进行藻溶弧菌（Vibrio alginolyticus）感染，Prx的表达量在初期阶段稍有增加，而后Prx转录水平逐渐下降，并在12 h时下降到最低，仅为对照组的18%。表明Prx可能参与了三疣梭子蟹的细菌感染反应。

Prx4 在过氧化物还原酶家族中是唯一具有分泌性信号肽功能的蛋白，首次发现Prx4作为损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns,DAMPs）发挥抗病毒作用。在日本囊对虾中发现，在受到WSSV 感染后，Prx4 的表达量明显上调，胞外Prx4 的分泌增加。作为DAMPs 的胞外MjPrx4通过激活转录因子Dorsal使相关抗病毒抗菌肽表达上调，从而抑制WSSV 的增殖。这为甲壳动物由WSSV 引起的疾病的预防和治疗提供了新的研究思路[50]。

3.2 理化因子刺激下甲壳动物Prx的生物学功能

作为小型甲壳动物，中华卤虫在水产养殖中具有颇高的营养价值。周茜[51]研究了被硫酸铜刺激的中华卤虫幼体中Prx基因的表达变化，结果显示：在刺激6 h 后，Prx的表达水平略有增加（P＞0.05），而后逐渐减少，12 h 时降至最低；刺激后12～24 h 时，Prx的表达水平急剧增加，24 h时达到峰值。说明硫酸铜刺激后并且随着时间的增加，大量的活性氧在体内产生，诱导Prx基因的表达上调，以清除过多活性氧，防止对正常细胞造成损伤。卜瑞倩[35]研究了斑节对虾在pH、盐度和重金属胁迫下过氧化物还原酶的表达模式，结果显示：PmPrx1在重金属铜刺激下，表达量呈逐渐下降的趋势，于48 h时降至最低，与对照组差异显著（P＜0.05）；在pH 7 的海水处理下，PmPrx1的表达量逐渐升高，12 h时升至最高，与对照组差异显著（P＜0.05），后逐渐下降并恢复至正常水平；在pH 9 的海水处理下，仅在96 h 时表达量极显著升高（P＜0.01）。在高盐应激时，PmPrx1的表达量在8 h最高（P＜0.01），而后逐渐降低；低盐应激时，在16 h表达量最高（P＜0.01）。这些结果表明PmPrx1可能参与了非生物毒性应激。

综上所述，Prx在甲壳动物中的主要作用为清除自由基和抗氧化（表4），在氧化应激的情况下，Prx家族基因表达量明显增加，以清除氧化应激产生的过多活性氧。Prx基因的表达可作为确定环境对生物影响的重要指标，检测其表达变化已成为毒理学研究的重要方法[52]。

表4 甲壳动物Prx的生物学功能研究汇总Table 4 Summary of biological function research of crustacean Prx

4 展望

Prx 广泛存在于多种生物体中，在生物体对活性氧分子的防御中起着至关重要的作用。随着研究的深入，这个家族的生理生化功能已逐渐显现在人们面前。许多研究表明，Prx 参与了多种生物学过程，包括氧化还原调节，细胞增殖、分化和凋亡等。目前，虽然在许多物种中发现了Prx，但在甲壳动物中，尤其是虾蟹Prx的研究仍处于初期阶段，还有许多物种的过氧化物还原酶基因尚未被发现，研究得还不够深入，未来还需要从以下2 方面进行探索：一是克隆出更多的甲壳动物Prx基因亚型，同时，需要对甲壳动物中未分化的基因进行更深入的研究。二是探究Prx在甲壳动物生物和非生物胁迫中抗氧化能力的生物学功能，对其在氧化条件下的作用机制和其他功能进行深入研究。总之，通过研究甲壳动物过氧化物还原酶，可以加深人们对无脊椎动物免疫防御机制的了解，为进一步研究甲壳动物固有免疫作出贡献。