ABCC11基因多态性对非小细胞肺癌患者S-1辅助化疗预后的价值分析

邢国柱 沈会华 李悟

肺癌是世界上最常见的癌症相关死亡原因[1]。为了预防肺癌复发，临床上已建立了非小细胞肺癌(NSCLC)术后ⅠB～ⅢA期患者的辅助化疗方案[2,3]。目前所使用的辅助化疗的标准方案是静脉注射顺铂，另一种辅助性化疗药物为尿嘧啶-喃氟啶，是5-氟尿嘧啶(5-Fu)的前体药物，这种口服药物也已被证明也对IB期肺腺癌的治疗有效[4]。S-1是另一种口服氟嘧啶衍生物，由替加氟、5-氯-2,4-二羟基吡啶(CDHP)和氧酸钾(Oxo)3种成分组成[5]。以S-1为基础的化疗在辅助治疗中起到的积极作用已在多种癌症治疗中得到证实，包括胃癌、胰腺癌、结肠癌等[6-8]。ABCC11基因位于16号染色体上，是ATP结合盒转运蛋白超家族的一员，编码多耐药相关蛋白8(MRP8)，其对腋窝顶泌腺和初乳分泌功能具有重要的意义，且已有研究证明其参与调节5-Fu代谢[9,10]。5-Fu及其衍生物在细胞内被代谢为5-氟-2’-脱氧尿苷5’-单磷酸(FdUMP)，FdUMP被ABCC11/MRP8主动转运出细胞。ABCC11基因中的单核苷酸多态性(SNP)，例如538G/A，G180R，对分泌位置及功能具有重要作用，并且决定耳垢干湿性[11,12]。A/A等位基因型对应于干性耳垢，G/G和G/A等位基因型对应于湿性耳垢。因此，这些数据表明，调节耳垢类型的SNP538可能预测5-Fu的疗效。本研究为了阐明S-1辅助化疗后，ABCC11基因多态性对ⅠB～ⅢA期NSCLC预后的影响，究了肺癌患者5年生存率及其与临床病理因素的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年2月至2015年9月在本院诊治的60例NSCLC患者作为研究对象，其中男40例，女20例；平均年龄(58.4±10.2)岁，患者均要求符合以下标准：有组织学证据证明患者为非小细胞肺癌；根据国际抗癌联盟(UICC)/美国癌症联合委员会(AJCC) 1997年第5版指南，非小细胞肺癌完全切除后病理分期为ⅠB、Ⅱ或ⅢA；除手术外，未接受其他治疗；年龄20～80岁，有足够的口服摄取量，且表现状态(PS)为0或1[14]。所有患者进行了肺叶切除手术。患者均签订知情同意书，本研究同时经医院伦理道德委员会通过。见表1。

表1 非小细胞肺癌患者的基本特征

1.2 方法

1.2.1 治疗计划如下：化疗包括8个疗程，根据患者体表面积(BSA)的不同，S-1的给药剂量为80～120 mg/d。BSA <1.25 m2时,80 mg/d；1.25 m2≤BSA <1.5 m2时，100 mg/d，BSA≥1.5 m2，120 mg/d。S-1在术后4周内开始口服，2次/d，饭后服用。

1.2.2 使用QIAamp DNA迷你试剂盒(Qiagen,上海)按照说明书中描述的方法，从2～3个连续的10 mm切片中提取DNA。采用突变富集—多聚酶链反应—限制性片段长度多态性技术对突变热点进行了分析。

1.2.3 胸苷合酶(TS)、乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)、DPD的免疫组化染色。制备5 mm厚的肿瘤切片进行免疫组化染色。采用1∶1 000浓度的原代多克隆抗体(APExBIO，上海)结合DPD、OPRT和TS。以生物素化抗兔免疫球蛋白G和过氧化物酶标记链霉亲和素(Bersee，北京)为二抗检测DPD。采用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector，上海)作为检测TS和OPRT的二抗。使用3,3’-二氨基联苯胺观察抗体结合。肿瘤细胞免疫染色强度分为：0(无染色)、D1(弱染色)、D2(明显染色)、D3(强染色)。0级和1级进一步分为阴性，2级和3级为阳性。

1.3 统计学分析 采用JMP 11.0软件进行数据分析，采用Kaplan-Meier方法预测无复发生存期(RFS)和总生存期(OS)的时间-事件函数。RFS定义为从开始治疗之日起至最早出现复发之日或死亡之日(以先发生者为准)。OS定义为从开始治疗之日起至死亡或最后一次接触之日止的时间。log-rank检验用于检验预测时间-事件曲线之间可能存在的差异。单因素的预后相关性由多因素Cox回归分析确定。采用χ2检验分析复发和临床病理因素之间的关联。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5年生存率与临床病理因素相关性分析 在随访的60例患者中，16例死亡，44例分析时仍存活。5年的OS为73.3%。在16例死亡患者中，有11例在死亡前有复发记录，其余4例患者中，1例死于胆管癌，1例死于脑梗死，2例死于恶性淋巴瘤，1例死于腹膜癌。5年的RFS为69.5%。见图1。

图1 ⅠB～ⅢA期NSCLC患者接受S-1化疗后的5年OS(a)和RFS(b)

2.2 5年单因素分析 根据临床病理特点列出了5年的OS和RFS。OS单因素分析发现，鳞状细胞癌患者的OS比肺腺癌患者短(P=0.032)；肿瘤≥34 mm

的患者相较于肿瘤≤33 mm的患者OS也短 (P=0.013)。RFS单因素分析发现，功能状态评分(PS)≥1 (P=0.031)、淋巴管浸润(P=0.005)、血管浸润(P=0.003) 以及A/A型SNP538 (P=0.012)均表现出较短的生存时间。见表2。

表2 根据临床病理特征对非小细胞肺癌患者进行5年生存率分析

2.3 ABCC11基因与患者预后的关系 从接受S-1治疗的60例患者中挑选出40例疗效达到或超过70%的患者，对其5-年存活率进行分析，结果显示，A/A型SNP538(P=0.003)、TS 免疫组化结果为阴性(P=0.018)以及PS≥1(P=0.026)均为RFS较差的显著预测因子。多因素Cox回归分析发现只有A/A型SNP538表现出显著的危险比(P=0.002)。见图2，表3。

表3 根据40例S-1疗效较好的患者的临床病理特点进行单因素和多因素RFS分析

3 讨论

本研究中，S-1治疗NSCLS后5年OS和RFS发生率较高；ⅠB至ⅢA期患者的OS和RFS分别为73.3%和69.5%，与以往的研究结果[3]相当。虽然S-1在术后辅助治疗中具有较高的疗效，但是其确切作用机制尚不明晰。众所周知，尿嘧啶-喃氟啶的毒性极低，因此很适合作为口服药物长期(2年)使用，在此期间，它达到足够量的5-Fu，进而防止癌症复发或转移。由于S-1是一种类似的口服氟嘧啶，其1年的给药可能通过相同的机制导致良好的预后。以S-1为基础的化疗在辅助治疗中起到的积极作用已在多种癌症治疗中得到证实，包括胃癌、胰腺癌、结肠癌等[9-11]。与此同时，研究者还开展了基于S-1的NSCLC ⅠB期至ⅢA期辅助化疗的可行性研究，研究表明基于S-1的辅助化疗在ⅠB至ⅢA期NSCLC中均是可行的[13-15]。此外，口服药物治疗能够在门诊进行，可以维持患者的生活质量。

就治疗策略而言，以S-1为基础的治疗作为术前辅助化疗也具有一定的优势。在S-1治疗过程中，5-Fu代谢物FdUMP与TS形成极其稳定的三元复合物，阻断dUMP的甲基化，并且也阻止了dUMP转化为DNA合成所必需的dTMP[16,17]。因此，S-1抗癌作用的主要机理是抑制细胞分裂。另一方面，铂以几种不同的方式与DNA交联，通过干扰有丝分裂影响细胞分裂，破坏DNA结构，并引发DNA修复机制，进而激活细胞凋亡[18]。鉴于这些药物具有不同的抗癌机制，以S-1为主要的辅助化疗手段，复发后选择铂偶联治疗可能会有更好的疗效。

本研究的生存分析表明，较低的PS和淋巴管及血管浸润与较短的RFS时间有关。这些结果与以往研究的结果一致，血管浸润性肿瘤具有侵袭性生长以及转移的潜能，导致患者的预后不良[19]。A/A型SNP538也与较短的RFS有关，多因素生存分析表明，A/A型SNP538表现出统计学上较为显著的危险比。已有研究表明,ABCC11基因中的SNP538决定了耳垢的类型[19]。A/A等位基因型对应于干性耳垢，G/G和G/A等位基因型对应于湿性耳垢。由于G/G或G/A型SNP538患者没有复发，这一结果显示耳垢类型可以作为基于S-1的辅助化疗疗效的生物标志物。这些等位基因的频率存在较大的种族差异[20]，这表明基于S-1化疗的疗效也存在种族差异。然而，ABCC11基因的SNP538影响S-1辅助化疗患者预后的机制尚难解释。在一项基于细胞的研究中显示，ABCC11通过增强细胞内抗癌药物的外流，直接对培美曲塞产生耐药性。此外，A/A组培美曲塞的IC50较G/G或G/A组显著降低，说明A/A型SNP538患者对培美曲塞更为敏感[21]。在本研究中，A/A型患者的RFS率低于G/A或G/G型患者。有可能是因为S-1在活细胞中的积累，影响A/A型SNP538患者体内的稳态平衡，从而导致癌症的复发。低TS的表达与复发之间也存在关联。本研究的结果表明，接受S-1治疗的患者中，高TS表达组比低表达组表现出更好的RFS。以往也有很多研究表明，高TS表达确实可以预测良好的预后。Fujiwara等[21]利用老鼠模型，发现在高TS表达水平的胃癌中，S-1比5-Fu和尿嘧啶-喃氟啶的抗肿瘤疗效更好。我们推测S-1较高的DPD抑制作用增加了5-Fu代谢物的细胞内水平，并通过TS失活诱导TS成瘾性癌细胞的细胞毒性。

综上所述，本研究的5年生存率分析表明ABCC11基因中的A/A型SNP538是术后患者接受S-1辅助治疗是否会复发的重要预测因子。由于A/A型SNP538对应于干型耳垢，因此基于S-1的辅助化疗可能因耳垢类型的不同而产生个性化差异。