NLRP3炎性体在心肌缺血再灌注损伤中作用的研究进展

李丹，高珊△

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是全世界人群最主要的死亡原因之一，对全球造成了巨大的健康和经济负担［1］。心肌血运重建是AMI最有效的临床治疗原则，但缺血心肌的突然再灌注在恢复心肌血供的同时会加重心肌组织损伤，引起心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）。MI/RI的发病机制十分复杂，活性氧的产生、钙超载、中性粒细胞浸润以及细胞凋亡等均参与MI/RI的发生。其中，炎症反应与MI/RI密切相关。缺血再灌注损伤发生时，单核/巨噬细胞、中性粒细胞以及内皮细胞等炎症相关细胞通过一系列信号传导启动细胞炎症反应，引起多种炎性因子释放，导致血管通透性增加及组织水肿等损伤。这一炎症瀑布反应的重要步骤是白细胞与激活或受损内皮细胞的紧密黏附，该过程通过内皮细胞表面黏附分子及整合素的介导进行，随后，白细胞跨内皮细胞到达再灌注心肌组织，造成心肌组织的炎症损伤。巨噬细胞作为炎性细胞的一个重要类型，在心肌缺血及MI/RI中发挥重要作用。吸引到受损心肌组织的单核/巨噬细胞可以通过释放活性氧（reactive oxygen species，ROS）、炎性介质和蛋白酶而加重心肌的损伤。NLRP3炎性体是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）以及pro-半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）-1组成的一种多蛋白复合物，在炎症反应中发挥重要作用。如何在恢复缺血心肌血流的同时有效预防再灌注损伤仍是目前的难题。本文就NLRP3炎性体及其在MI/RI中的作用进行综述，阐述了ROS及其相关信号通路、微小RNA（microRNA，miRNA）以及免疫细胞对NLRP3炎性体的调控作用，并对通过干预NLRP3炎性体治疗MI/RI进行了展望。

1 NLRP3炎性体及其在MI/RI中的作用

炎性体是一种大分子多蛋白复合体，相对分子质 量 约700 ku［2］，通 过 模 式 识 别 受 体（pattern recognition receptor，PRR）识别病原微生物的病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）及内源性危险信号的损伤相关分子模式（damage associated molecular pattern，DAMP），进而启动免疫应答。NLRP3是核苷酸结合寡聚化结构域受体（nucleotide-binding oligomerization domain like receptor，NLR）的一员，属于胞浆内模式识别受体。当细胞受到刺激时，NLRP3激活并能够通过结合蛋白ASC招募pro-caspase-1，形成NLRP3炎性体。在炎性体的作用下，pro-caspase-1被激活成为caspase-1，最终导致白细胞介素（IL）-1β和IL-18的成熟与分泌，引起一系列炎症反应［3］。NLRP3炎性体激活机制包括钾外流、线粒体ROS产生、线粒体DNA释放以及溶酶体失稳后组织蛋白酶释放等。

MI/RI过程中心肌组织吸引大量白细胞，这些白细胞通过释放多种炎性细胞因子而进一步加剧心肌组织损伤。目前NLRP3炎性体已被广泛研究并证实在癌症［4］、糖尿病［5］、动脉粥样硬化［6］等多种炎症相关疾病中具有重要作用。另外，越来越多的证据表明NLRP3炎性体亦在MI/RI中发挥重要作用［7-8］。

有研究显示，急性冠脉综合征患者血小板NLRP3表达水平较健康对照组及稳定型心绞痛组患者明显增高，并且在经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后患者中，血小板NLRP3高表达者的预后较NLRP3低表达者差［9］。抑制NLRP3炎性体激活可以减轻MI/RI模型心肌纤维化程度及炎症水平。一种小分子NLRP3炎性体抑制剂MCC950可以通过抑制早期炎症反应而减轻心脏纤维化并改善心肌功能［10］。在MI/RI中，抑制NLRP3炎性体激活而发挥心脏保护作用的机制可能涉及RISK通路激活、线粒体功能改善、细胞自噬［11］以及抑制ROS/核因子（NF）-κB/NLRP3途径［12］等。

2 ROS及其相关信号通路对NLRP3的调控作用

2.1 ROS对NLRP3的调控作用 ROS属于体内高活性分子，包括超氧阴离子（.O2-）、羟自由基（.OH）和过氧化氢（H2O2）等。正常生理情况下，机体会产生少量的ROS，同时具有氧自由基清除功能，使ROS代谢保持平衡，这种情况下并不会诱导氧化应激损伤。当MI/RI发生时，机体通过线粒体呼吸链、花生四烯酸代谢、黄嘌呤氧化酶等途径产生大量的ROS，过量ROS又可通过阻断细胞信号转导、激活炎性因子、诱发脂质过氧化等引起细胞损伤甚至死亡。线粒体是细胞内氧化反应进行的重要场所，也是细胞ROS产生的主要来源。

ROS在MI/RI中发挥重要作用。还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶可以引起ROS产生增加及MI/RI加重，与野生型小鼠相比，在NADPH氧化酶敲除小鼠MI/RI模型中，ROS产生减少，并且心肌梗死面积也变小［13］。在H9C2细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型中，抑制SIRT1/FOXO1/Mn-SOD抗氧化信号途径会增加ROS的产生，加重H/R损伤，而激活SIRT1/FOXO1/Mn-SOD抗氧化信号通路可减少H/R诱导的ROS产生，发挥心肌细胞保护作用［14］。

在大鼠MI/RI模型中，NLRP3炎性体及其下游炎性因子IL-1β表达显著增高；在细胞模型上对其机制进一步研究发现，NLRP3的激活和ROS产生及细胞外信号调节激酶（ERK）和p38磷酸化有关［15］。在另一项以大鼠MI/RI为动物模型和以原代心肌细胞为细胞模型的研究中发现，芒柄花黄素可以通过抑制ROS-硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxininteracting protein，TXNIP）-NLRP3表达而发挥心脏保护和抗炎作用［16］。

2.2 JNK/p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信号通路对NLRP3的调控作用 在MI/RI过程中，ROS可以诱导MAPK信号通路的激活，包括c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK，而MAPK在MI/RI中发挥重要作用。再灌注损伤时ROS诱导的细胞凋亡与p38 MAPK表达增加有关，再灌注早期产生的过量ROS可以激活JNK、p38 MAPK，诱导细胞凋亡，而抑制ROS水平可降低H/R心肌细胞JNK、p38蛋白表达水平，并减少细胞凋亡［17］。本课题组前期研究表明，丹参酮ⅡA可调控ROS/p38/NLRP3通路发挥抗炎作用［12］。

2.3 Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）4/MyD88/NF-κB信号通路对NLRP3的调控作用 研究发现，调控TLR4-MyD88-NF-κB/NLRP3信号通路可以减轻缺血诱导的心肌炎症［18］。在大鼠MI/RI模型中，抑制TLR4介导的NF-κB/NLRP3信号通路及其诱导的炎症反应可以发挥心脏保护作用，包括减少心肌梗死面积，改善心功能，减轻炎症反应等［19］。另有研究表明，在冠状动脉微栓塞的大鼠模型中，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路参与心肌炎症反应，其可激活NLRP3炎性体，诱发炎症瀑布反应而加重心肌组织损伤；而阻断TLR4/MyD88/NF-κB信号通路可减轻心肌组织损伤并改善心肌功能［20］。ROS及其相关信号通路对NLRP3的调控作用见图1。

Fig.1 The effects of ROS and its related signaling pathways on NLRP3 inflammasome图1 ROS及其相关信号通路对NLRP3炎性体的调控作用

3 miRNA对NLRP3的调控作用

miRNA是近年发现的一种内源性单链小分子RNA，大约由22个碱基构成，分布于各种生物中，通过结合到信使RNA（mRNA）的3'-非翻译区（3'-UTR）上的靶位点，实现对靶基因mRNA的剪切或对靶基因mRNA翻译的阻遏，在生物的发育、繁殖、细胞分化及凋亡等方面发挥重要作用［21］。一种miRNA通常能够调节多种mRNA，这些mRNA编码的蛋白质一般参与共同的生物过程，如细胞分化。

3.1 miR-223 miR-223参与调节红细胞、粒细胞以及巨噬细胞的分化，调节炎性细胞的活化，影响机体炎症反应［22］。miR-223在调控细胞增殖、分化以及抑制炎症反应过程中发挥重要作用。miR-223为炎症反应中的负调控因子，通过对信号传导与转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3的直接作用来调节促炎细胞因子的表达［23］。巨噬细胞是炎症反应的重要介质，TLRs是急性炎症的诱导者。miR-223在TLR激动剂刺激巨噬细胞激活过程中表达下调，并且miR-223可通过作用于RhoB而抑制其下游NF-κB和MAPK信号通路及促炎细胞因子的表达，包括肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6和IL-1β等［24］。与野生型小鼠相比，miR-223转基因小鼠在MI/RI后心脏收缩性得到改善，心肌组织坏死面积变小［25］。

3.2 miR-495 miR-495被认为是一种肿瘤抑制miRNA，可显著抑制细胞集落生成能力，诱导细胞分化，并有效抑制细胞生长/增殖及促进细胞凋亡，降低细胞生存能力［26］。研究表明，与健康对照人群相比，冠状动脉疾病患者血浆miR-495水平显著下降；在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中过表达miR-495可以促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，这一作用可能是miR-495通过直接调节CCL2基因表达实现的［27］。在小鼠MI/RI模型及H2O2诱导的H9C2细胞模型中，miR-495均下调；并且miR-495对H2O2诱导的H9C2细胞炎症反应具有抑制作用，包括抑制TNF-α、IL-1β、IL-18等炎性因子的表达［28］。有研究表明，假手术组小鼠心肌miR-495阳性率明显高于MI/RI组，而MI/RI组小鼠心肌NLRP3表达水平显著高于假手术组；在心脏微血管内皮细胞（cardiac microvascular endothelial cell，CMEC）模型中，miR-495可以通过抑制NLRP3炎性体信号通路减轻细胞损伤和炎症反应［29］。在冠状动脉疾病中，miR-495可以抑制细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表达，阻断NF-κB途径，从而减轻内皮细胞炎症反应，抑制内皮细胞凋亡及促进细胞增殖［30］。miR-495可以通过影响NLRP3炎性体的稳定性而调控NLRP3炎性体的表达，抑制NLRP3炎性体激活及脂多糖（LPS）诱导的炎症反应和细胞焦亡［31］。

3.3 miR-22 miR-22是一种在多种类型肿瘤中发挥抑制作用的miRNA。有研究表明其具有神经保护作用，可以抑制神经元凋亡［32］。miR-22过表达可以作用于沉默信息调节因子（silenced information regulator，Sirt）1，调控PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号通路，减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡，提高细胞活性和改善心肌损伤，从而发挥心脏保护作用［33］。miR-22过表达还可以通过调控JAK1/STAT3信号通路而减轻心肌细胞损伤［34］。体内及体外研究表明，miR-22与NLRP3和caspase-1表达呈负相关，且miR-22可以通过抑制NLRP3炎性体激活而下调炎性因子表达水平，进而发挥对内皮细胞的保护作用［35］。

4 NLRP3对免疫细胞的调控作用

4.1 NLRP3对巨噬细胞的调控作用 巨噬细胞是炎性细胞的一个重要类型，在心肌缺血及MI/RI中发挥重要作用。巨噬细胞在机体代谢、血管生成、细胞凋亡以及肿瘤形成等过程中均发挥重要的调节作用。巨噬细胞在不同刺激下可极化为经典活化巨噬细胞（M1型巨噬细胞）以及替代活化型巨噬细胞（M2型巨噬细胞），2种极化的巨噬细胞功能相互拮抗，并且M1/M2型巨噬细胞的相互转化和2种巨噬细胞比例的变化可以调节组织微环境的变化。

巨噬细胞M1型极化状态可由LPS、干扰素（interferon，INF）-γ、粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）等刺激诱导［36］，具有更强的吞噬力，分泌多种促炎介质，如一氧化氮（NO）、IL-6等，加剧炎症反应及组织损伤程度。M1型巨噬细胞分泌的促炎介质可以引起局部炎症，促进细胞外基质成分降解，诱导冠状动脉疾病的发生，并最终加速不稳定斑块破裂，导致血栓形成的风险增加，严重者造成心肌梗死甚至猝死。M2型极化状态可由IL-4、IL-13等细胞因子诱导，分泌多种抗炎介质，抑制免疫炎症反应，发挥组织损伤保护的作用［37］。有研究表明，M2型巨噬细胞来源的外泌体可以通过下调TXNIP蛋白和抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎性体信号途径而减轻MI/RI［38］。在大鼠心肌梗死模型中，巨噬细胞NLRP3炎性体表达上调，NLRP3炎性体在M1型巨噬细胞中激活而在M2型巨噬细胞中被抑制，NLRP3炎性体在M1型巨噬细胞中激活的这一过程加剧了心脏纤维化。心肌梗死后M1型和M2型巨噬细胞均表达IL-1β，但是只有M1型巨噬细胞分泌激活的IL-1β［39］。通过调控M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，可以减轻MI/RI，其机制可能涉及JAK/STAT信号通路［40］、TLR4-高迁移率族蛋白（high mobility group protein，HMG）B1/CEBP-β途径及线粒体功能［41］等。

4.2 NLRP3对Th17/Treg细胞的调控作用 Th17细胞属于CD4+Th细胞亚群，Th17细胞可分泌IL-17、IL-17F、IL-21及IL-22等炎性因子，参与机体炎症反应，并参与心肌组织纤维化和心肌细胞凋亡等过程。Treg细胞是具有负向免疫调节功能的CD4+细胞，其可以修饰免疫应答，维持免疫抑制，防止自身免疫性疾病的发生。Th17与Treg细胞在机体免疫调控和疾病发生中的作用相反，当它们保持动态平衡时能够维持机体正常的免疫功能，而当两者比例失衡时则会引发炎症和自身免疫疾病。

Th17细胞产生的特异性细胞因子IL-17可以加速缺血心衰大鼠模型心肌纤维化和心肌重塑［42］。与健康对照组相比，心肌梗死患者血浆中IL-6和IL-17表达水平显著升高，外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中IL-23和维甲酸孤儿核受体（tretinoid-related orphan receptor，ROR）-γt表达水平亦显著升高［43］。而抑制Th17分化可以改善心肌功能，减轻缺血再灌注损伤后心肌炎性细胞的浸润以及细胞凋亡［44］。在缺血性心肌病中，Treg细胞功能受损，免疫抑制能力不足，表型由抗炎型向促炎型转变，从而加剧炎症反应和左心室重塑［45］。对于心肌缺血患者，调节免疫细胞功能及T细胞分化可减轻心肌缺血后心肌损伤［46］。目前关于NLRP3对Th17/Treg细胞分化的研究主要集中在一些自身免疫性疾病［47］、感染性疾病［48］以及炎症性疾病［49］。而对于在MI/RI中NLRP3可否通过调控Th17/Treg细胞分化而影响心肌损伤尚有待进一步研究。miRNA对NLRP3炎性体及NLRP3炎性体对及免疫细胞的调控作用见图2。

Fig.2 The effects of miRNA on NLRP3 inflammasome and its regulation on immune cells图2 miRNA对NLRP3炎性体及NLRP3炎性体对及免疫细胞的调控作用

5 展望

NLRP3炎性体在MI/RI中发挥重要作用，可以产生IL-1β并且引起炎症瀑布反应。因此，NLRP3炎性体及IL-1β可以作为MI/RI的潜在治疗靶点。许多化合物和因子可以抑制NLRP3炎性体激活，并且在动物模型中显示出有效作用，其中包括多种中药有效成分，如灯盏乙素［50］、异嗪皮啶［51］、大黄素［18］、丹参酮ⅡA［12］、芒柄花黄素［16］及麝香酮［52］等，但是目前鲜见选择性NLRP3抑制剂的临床研究报道。重组IL-1β受体拮抗剂或抗IL-1β单克隆抗体用于心肌梗死患者的临床试验显示，IL-1β抑制剂可以显著降低心肌梗死患者心血管事件及炎症发生风险［53］，但是这些临床试验样本量相对较小，并且结果尚存争议［54］。NLRP3炎性体抑制剂对MI/RI的潜在治疗作用尚需进一步研究验证。