小白菜抵御虫害时硫苷含量变化的探究

在植物的一生中，它面临着非常复杂、充满威胁的生存环境，要面临灭绝的危险，但植物通过物种进化的方式形成了各种各样的防御机制。十字花科植物中有很多种类是我国重要的经济作物，比如小白菜、芥菜、甘蓝、油菜等。而小菜蛾是一种喜好取食十字花科植物的杂食性昆虫，特别是当小菜蛾成长为2～3龄幼虫时，对十字花科植物有极大的危害性，给我国的农业生产带来了不可估量的经济损失。硫代葡萄糖苷（简称硫苷）是一种特殊的存在于十字花科植物中的次生代谢物质，在植株的防御机制中发挥着重要作用，同时，硫苷还赋予了十字花科植物特殊的风味，在人类的防癌、抗癌方面也有一定功能。我们的课题就是研究十字花科蔬菜的小白菜是如何在小菜蛾取食的情况下诱导产生出一系列防御机制的。在我们的实验中，发现了：在被害虫取食72h 后，小白菜植株被害虫取食的地上部分叶片的硫苷含量趋于增加，硫苷可以在植物体内形成非均匀分布的模式，并且容易遭受昆虫取食的部位和植物的繁殖器官容易积累更多硫苷。

引言

植物的进化面临着复杂多变的环境，比如被害虫取食，被动物当作食物，被人类当作粮食，甚至生存环境会被洪涝、干旱等极端条件影响，或者被细菌病毒浸染。因而进化出了一系列防御机制，如“组成型防御”指的是植物利用自身固有特征，来阻止昆虫取食或病原菌浸染，这种防御方式是植物与生俱来的，外界环境对其影响不大，并且可以在植物体内持续地发挥作用；而“诱导型防御”则指的是植物因为遭受昆虫取食或被机械损伤等行为的诱导，而产生了某种物质来避免或减少被取食造成的伤害，这是在植物被外界损伤后才表现出的防御反应，例如烟草被害虫取食后会让根部开始生产尼古丁将害虫毒死，从而达到防御的目的。

十字花科是一个经济价值较大的科。全世界有300属以上，3200种左右。主产地为北温带。在我国有95属，400余种，全国各地均有分布，其中以西北、西南及东北的高山区或丘陵、平原地带分布为多，是我国主要的经济作物。一般可分为四类：甘蓝类、芥菜类、白菜类和萝卜类。

小菜蛾，鳞翅目菜蛾科，主要为害的蔬菜品种包括甘蓝、紫甘蓝、青花菜、薹菜、芥菜、花椰菜、白菜、油菜、萝卜等十字花科农作物。其为害特点：初龄幼虫仅取食叶肉，留下表皮，在菜叶上形成一个个透明的斑，即常说的“开天窗”。3～4龄幼虫可将菜叶食成孔洞和缺刻，严重时植株全叶被吃成网状。在苗期常集中心叶为害，影响包心。在留种株上，危害嫩茎、幼荚和籽粒。

硫代葡萄糖苷（简称硫苷），是十字花科蔬菜中的重要的也是其特有的一种次生代谢产物。学者根据侧链基团的不同，把硫苷分为三大类，包括脂肪族硫苷、芳香族硫苷与吲哚族硫苷。硫代葡萄糖苷不仅在植株的防御机制中起着举足轻重的作用，同时，十字花科植物中存在的特殊风味也与硫苷有关，而且硫苷还在人类的健康方面也有一定功能，科学家倡导常吃白菜、萝卜、甘蓝等新鲜蔬菜可以防癌便是出于十字花科蔬菜含有硫苷的原因[2]。

我们选择这个课题，希望通过比较农业生产中广泛种植的小白菜在受到杂食性昆虫小菜蛾的取食为害后，植株体内硫苷含量是如何变化的，希望研究硫苷在十字花科植物防御体系中发挥的作用，在未来可以更多地去提取该类硫苷来开发“绿色农药”帮助十字花科植物建立更佳优越的防御机制。

材料和方法

实验材料

十字花科蔬菜：小白菜，2～3龄小菜蛾幼虫，育苗营养钵，基质土，光照培养箱，塑料罐。

实验方案

育苗：将四种蔬菜分别播种于育苗盘当中，做好标记，标明播种时间。

移栽：等待3～4天，幼苗长出3～4片叶子后，选择长势一致的幼苗，小心移植到营养钵中，移植过程中注意避免机械损伤。

培养：为了防止其他虫害和机械损伤，将植株放置在光照培养箱中进行育苗培养。待幼苗长至四叶一心、八叶一心和十二叶一心，对幼苗进行虫吃处理。

虫吃处理：实验处理前，将小菜蛾进行饥饿处理5h，然后把小菜蛾放置在叶片上，每棵植株上放置3头。再把塑料罐的底部用剪刀剪去，透明塑料罐倒扣在营养钵上，这样既能透气又能透光，同时用圆形纸片将营养钵中的土全部盖住，以上措施主要为了防止小菜蛾逃逸。

观察与检测：分别于不同时间进行观察并拍照记录。虫吃处理后，进行硫苷含量的检测。

硫苷提取：取样时以三株为一组处理，并且每组设置三次生物学重复，植株成熟并进行接虫处理采收后，分别做好标记放入提前准备好的网袋中，进行液氮速冻保鲜。然后存放于-80℃冰箱，以便用于硫苷的提取和检测。检测时先对样品进行萃取，提取出硫苷后采用高效液相色谱法分析样品中的硫苷含量[3]。

数据处理，采用Excel进行数据处理与作图，SPSS进行差异显著性分析。

结果与分析

小菜蛾取食小白菜时间的探究

我们根据观察实验，发现小菜蛾对于小白菜的取食偏好主要集中在新生叶片部分，而且相比于八叶期植株和十二叶期植株，小菜蛾更偏好于取食四叶期植株。越靠近植株包心部分，受小菜蛾取食也更严重。此外，随着时间的延长，虫龄越大，植株被损害程度也越严重。

不同生长期小白菜硫苷含量的分析

通过文献查询确定植株体内硫苷组分，使用高效液相色谱法对小白菜植株中不同种类的硫苷含量进行分析，比较鉴定出小白菜植株中硫苷种类一共有8种（图2），他们的名称分别是：2-羟基-3-丁烯基硫苷、5-甲基亚硫酰戊烷基硫苷、3-丁烯基硫苷、4-羟基-3-吲哚基硫苷、4－戊稀基硫苷、2-苯乙基硫苷、4-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷、1-甲氧基-3-吲哚基甲基硫苷。

图2 小白菜硫苷种类的液相色谱图

此外，不同时期总硫苷和各类硫苷的含量也有所不同，即四叶期植株、八叶期植株和十二叶期植株中叶片的硫苷含量也存在不同。从四叶期植株到八叶期植株，我们发现叶片中的硫苷含量呈显著上升趋势（p＜ 0.05），而八叶期植株硫苷含量则达到峰值，到十二叶期时植株的硫苷含量有所下降（图3）。其中，小白菜植株中吲哚族和芳香族的硫苷含量变化趋势与总硫苷含量的变化趋势一致，即在八叶期时含量最高，而在四叶期和十二叶期含量较低。脂肪族硫苷的含量则是随着叶期的生长而呈现逐渐下降的趋势，在十二叶期时含量达到了最低。另外，从图中还可以发现，在不同的时期，小白菜植株中脂肪族硫苷、吲哚族硫苷和芳香族硫苷的含量分别占总硫苷含量的比重也有所不同。在植株四叶期时，脂肪族硫苷含量的占比是最高的，约占总硫苷含量的 65%；生长至八叶期时，吲哚族硫苷含量所占的比重最大，占总硫含量苷的 48%；到十二叶期时脂肪族硫苷与吲哚族硫苷的含量相差不大。此外，在这三个时期当中，芳香族硫苷的含量所占比例都是最低的。

图3 不同时期总硫苷和各类硫苷的含量比较

联系我们的观察实验，这一结果告诉我们，对于小白菜植株来说，四叶期相比于八叶期和十二叶期来说更容易遭受昆虫取食或者承受更多潜在的其他威胁，所以小白菜植株体内产生了更多脂肪族硫苷来帮助植株抵御外界给小白菜带来的危害；而随着植株的生长，到八叶期时植株体内的硫苷含量累计达到了峰值，且增加的硫苷也主要以吲哚族和芳香族硫苷为主，脂肪族硫苷含量则在慢慢减少。

小菜蛾取食后小白菜中硫苷含量变化

我们对不同时期的小白菜进行含量检测，发现小白菜在八叶期含量已累计达到峰值，说明此前小白菜硫苷含量处于加速积累状态，因此为了减小因植株生长造成的硫苷含量增加的误差，我们在探究小白菜被杂食性昆虫小菜蛾取食后植株体内硫苷含量的变化时，选择的是长势一致的八叶期植株，在光照培养箱中接同一时期的小菜蛾幼虫，分别提取不同时间的对照植株和进行了接虫处理后叶片中的硫苷，利用高效液相色谱法进行对照组和实验组硫苷含量的鉴定。发现接虫处理后植株总硫苷在被昆虫危害的不同时间植株体内硫苷含量的变化都有所不同（图4）。

图4 小菜蛾取食对小白菜中总硫苷各类硫苷含量的影响

对小菜蛾取食后的72h内选取了四个时间点：1h、24h、48h和72h进行硫苷含量的检测。我们发现，随着时间的延长，不论是总硫苷含量还是各不同种类的硫苷含量，都表现出整体上升趋势，这一结果说明小菜蛾取食确实能够引起硫苷含量的增加。

在我们的实验结果中，植株被昆虫取食 1h 后，硫苷含量增加不显著(p＜ 0.05)，24h 后硫苷含量明显上升，与对照差异性显著，在48 h 后硫苷的含量呈增加趋势，但上升的幅度却逐渐减弱，被小菜蛾取食72h 时达到其最高值2.02μmol/g，相比对照的 1.15μmol/ g，含量了上升将近 0.8倍。在被小菜蛾取食前后，小白菜植株体内的脂肪族硫苷在总硫苷含量中都确实占主要比重，而被小菜蛾取食 1h 后脂肪族硫苷明显上升，随取食时间的延长，脂肪族硫苷的含量逐渐升高，48h 达到最高值1.135μmol/ g，比对照组硫苷含量增加了 59%。此外，吲哚族硫苷含量的变化与总硫苷含量的变化趋势一致，含量最高的 72h 相比于对照增加 136%。芳香族硫苷的含量较低，被小菜蛾取食24h 后达到最高，增加近 63.5%，而在被小菜蛾取食 48h 和 72h后，芳香族硫苷的含量都出现了显著降低。

结果与讨论

在抵御十字花科植物被害虫取食方面，硫苷一直扮演者十分重要的角色。本实验研究了小白菜在不同叶期时叶片中硫苷含量的变化，发现四叶期到八叶期硫苷含量加速累积，十二叶期时叶片中的硫苷含量下降，说明小白菜叶片在不同生长期的硫苷含量处于不断的变化之中。硫苷在植株的体内是不断产生和积累的，而十二叶期硫苷含量的下降，则可能是因为植株中硫苷的积累速率是不高于植物的生长速率的，所以表现出来了硫苷在植株体内出现含量降低的情况，同时也有可能是由于随着植株的不断生长和发育，叶片新合成的硫苷又被运输到了植物的茎部或地下根等其他部位的器官所导致的。除此之外，本实验还发现，小白菜在生长至四叶期时受昆虫取食为害最为严重，所以小白菜植株体内会产生更多硫苷希望帮助植株抵御昆虫取食给小白菜带来的危害，而这些产生的硫苷在植株生长至八叶期时累积达到了峰值；同时，在遭受害虫取食为害1h，硫苷含量即开始上升，待被为害24-48h时，植株体内的硫苷处于加速积累的过程，而且产生的硫苷也主要以脂肪族硫苷和吲哚族硫苷为主，这证明了小白菜在处于不利环境时，植株体内会产生更多硫苷以帮助植株减少和抵御来自外界环境的侵害。

为了揭示害虫取食植株后引起硫苷含量变化的反应机理，我们利用害虫小菜蛾对十字花科蔬菜品种小白菜进行接虫处理，能够帮助我们更加深入地了解硫苷在植物抗虫防御体系中所起到的重要作用。在我们的实验中发现：在被害虫取食72h 后，小白菜被害虫取食的地上部叶片硫苷含量增加，说明硫苷介导的防御体系的确响应了害虫胁迫，对增加植物抗虫的阻力也会起到一定的作用。此外，研究表明，硫苷可以在植物体内形成非均匀分布的模式，而且在易受昆虫取食的部位以及植物的繁殖器官当中会容易积累更多硫苷。

在实验过程中，由于时间和条件的限制，我们无法测量虫体内的解毒酶来观察虫体的变化，所以用测量植株内的硫苷含量变化来进行替代。不同植株和种类中硫苷的含量也存在很大差别，这些差别究竟对植物的防御起到了怎样不同的影响，这些问题有待于我们进一步去研究发现。明确以硫苷介导的植物防御机理，这对于将来在植物抗菌、抗虫和抗病方面的研究将会有重要意义[4]。

本研究创新点

在对各类文献的查找过程中，我们发现虽然有关十字花科植物硫苷产生机制的研究比较多，但对于害虫取食诱导十字花科产生硫苷防御机制的研究并不多。我们在本实验中设置了植株在不同生长时期（四叶期、八叶期和十二叶期）被害虫取食做比较，发现害虫更倾向于取食四叶期植株，而且从四叶到八叶这一段时期硫苷是呈加速积累状态的；此外我们还设置了被害虫取食后不同时间（1h、24h、48h和72h）测量硫苷变化，发现被害虫取食72h时达到最高值，而且脂肪族硫苷在植株防御机制中更起着主要作用。

研究感悟

植物为了生存必须拼尽全力，它们的祖先们由于承受了巨大的被取食的压力，所以需要不断进化，进化出了一系列防御机制。根据防御方式的不同，我们可以将这种进化出来的优异性状防虫术统分为两类：一类是非常直接的，称之为“直接防御”。比如，有些植物会让自己变得很难吃，于是虫子吃得就少了，或者干脆不吃了；有些植物长出坚硬锋利的刺、毛，严禁虫子靠近，或者给自己穿上厚厚的盔甲，增强角质层的厚度，增多蜡质的合成，让虫子们咬不动；植物还可以通过改变果实和叶片的形状、大小、颜色，改变植株性状等进行直接防御。另外一类植物的防御方式是间接的，称之为“间接防御”。有的植物在遭受虫子袭击的时候就释放出一些挥发性化合物，释放到空气中，引诱植物的天敌前来捕食虫子。此外，次生代谢产物在植物的整个代谢活动中都具有重要作用。大量的文献表明，次生代谢物质在植物的抗虫、抗病、抗逆方面起重要作用，有的次生代谢产物可以增强植物的抗虫性、抗病性，有的则可以作为植物逆境传递信号等，比如十字花科植物中特有的硫苷[5]、橡胶树产生的大量橡胶[6]和甜菊叶中特有的甜菊甙[7]等都是重要的植物次生代谢产物。

研究表明，植物和昆虫的关系可以分为两类：一类是相互受益，比如，昆虫给植物传播花粉，而植物为昆虫提供食物然而，自然界中更普遍的植物和虫的关系却是第二类——单纯的取食行为。事实上，所有的植物都会被至少一种虫类所取食，这就是共进化理论。植物为应对极大的环境挑战二形成了各自的防御机制，包括组成型防御，如许多植物都只是靠吸收土壤里的营养而生长，但猪笼草却与众不同——它不但靠吸收土壤里的营养而生长，还吸收昆虫里的营养；或诱导型防御，如植物通过进化，产生一系列的次生代谢物，十字花科植物就产生了特殊的次生代谢产物——硫苷，保护了自身。在这个实验当中，我更加深刻地认识了植物防御机制的重要性，虽然对我来说这个实验比较难，但是在指导老师的帮助下我学会了很多知识，比如硫苷的提取、液相色谱图的分析、怎样去计算硫苷含量等，都是在学校里学不到的知识。这项研究让我对化学、生物产生了很大兴趣，希望未来我也可以为我国的科研事业出一把力！