祛风解痉方对哮喘模型小鼠γδT淋巴细胞表达的影响

樊长征 苗青 洪巧瑜 崔云 何沂 张琼 张文江

摘要 目的：探討祛风解痉方对哮喘模型小鼠γδT淋巴细胞表达的影响。方法：以卵清蛋白滴鼻的方法建立哮喘Balb/c小鼠模型。动物分组：将30只小鼠随机分为正常组、模型组、醋酸泼尼松片组（0.27 mg/d）及3个祛风解痉方组（0.59、1.18、2.36 g/d），分别进行干预，给药14 d，1次/d。结果：与哮喘模型组比较，祛风解痉方低剂量组的γδT细胞的细胞活性差异无统计学意义（P>0.05），而祛风解痉方中剂量组、祛风解痉方高剂量组及阳性药物组的γδT细胞的细胞活性显著降低（P<0.05）。与模型对照组比较，祛风解痉方低剂量组的IL-5、IL-13、TGF-β、IL-10、IFN-γ水平差异无统计学意义，而祛风解痉方中剂量组、高剂量组以及醋酸泼尼松片组在治疗后IL-5、IL-13、TGF-β的表达均显著降低（P<0.05），IL-10、IFN-γ的表达均显著升高（P<0.05）。结论：祛风解痉方通过抑制γδT细胞的细胞活性，降低γδT细胞分泌的细胞因子IL-5、IL-13、TGF-β表达，调高IL-10、IFN-γ的表达抑制气道炎性反应，改善哮喘小鼠的气道高反应性。

关键词 祛风解痉方药;哮喘;γδT淋巴细胞;细胞因子;细胞活性;气道高反应性;气道炎性反应;中医药治疗

Effects of Qufeng Jiejing Formula on the Expression of γδt Lymphocyte in Asthmatic Model Mice

FAN Changzheng1，MAO Qing1，HONG Qiaoyu2，CUI Yun1，HE Yi1，ZHANG Qiong1，ZHANG Wenjing1

（1 Department of Respiration，Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Science，Beijing 100091，China;

2 Department of Traditional Chinese Medicine，Beijing Health Vocational College，Beijing 101101，China）

Abstract Objective：To investigate the effects of Qufeng Jiejing Formula on the expression of γδT lymphocyte in asthmatic model mice.Methods：The asthmatic Balb/c mice model was established by ovalbumin nasal drops.Animal grouping：a total of 30 experimental mice were randomly divided into a normal group，a model group，a prednisone acetate tablet group（0.27 mg/d）and a 3 Qufeng Jiejing Formula groups（0.59，1.18，2.36 g/d）.The mice were given intervention for 14 days，once a day.Results：Compared with the asthma model group，there was no significant difference in the cell activity of γδT cells in the low-dose Qufeng Jiejing Decoction group（P>0.05），while the middle-dose Qufeng Jiejing Decoction group and the high-dose Qufeng Jiejing Decoction group and the cell viability of γδT cells in the positive drug group was significantly reduced（P<0.05）.Compared with the model control group，the levels of IL-5，IL-13，TGF-β，IL-10 and IFN-γ in the low-dose group of Qufeng Jiejing Formula had no significant difference，while the levels of IL-5，IL-13 and TGF-β in the middle-dose group，the high-dose group and the prednisone acetate tablet group decreased significantly after treatment（P<0.05），while the levels of IL-10 and IFN-γ increased significantly（P<0.05）.Conclusion：Qufeng Jiejing Formula can by inhibiting the cell activity of γδ T cells，reduce the expression of cytokines IL-5，IL-13，and TGF-β secreted by γδ T cells，increase the expression of IL-10 and IFN-γ，inhibit airway inflammation，and improve asthmatic mice

Keywords Qufeng Jiejing Formula; Asthma; γδT lymphocyte; Cytokines;Cytoactive; Airway hyperresponsiveness; Airway inflammation; TCM treatment

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.012

支气管哮喘（以下称哮喘）主要特点表现为慢性气道炎性反应及气道高反应性，其发生发展的关键为Th1/Th2失衡，众多细胞和因子影响着Th1/Th2平衡，其中γδT细胞表达变化影响着Th1/Th2应答平衡，与哮喘发生发展密切相关，因此研究γδT细胞表达变化受到越来越多重视[1-3]。

根据受体不同，T细胞分为αβT细胞和γδT细胞，αβT细胞在外周血中约>90%，γδT细胞主要存在黏膜上皮及表皮组织中，约10%～50%[4]，γδT细胞在黏膜上皮及表皮中大量表达，表明其在黏膜免疫调节及防御中发挥着重要作用[5]，γδT细胞功能的参与和执行者主要为Th1型IL-2、IFN-γ、TNF-α及Th2型IL-6、IL-4等细胞因子[6-7]。根据δ链的不同，人γδT细胞分为δ1和δ2 2个亚群，根据γ链不同，分为Vγ1、Vγ4、Vγ5、Vγ6亚群。前期研究表明卵清蛋白（OVA）致敏的小鼠哮喘模型中，Vγ1+γδT细胞亚群增强了哮喘小鼠气道高反应性[8]，同时Vγ1+γδT细胞可降低IL-10和TGF-β的表达减轻哮喘小鼠气道炎性反应[9]，研究也表明Vγ4+γδT细胞下调Th2型应答，降低哮喘小鼠气道高反应性[10-11]，因此，哮喘发生发展的主要细胞群为Vγ1γδT和Vγ4γδT细胞。

中医学者在临床中发现“风盛”是哮病发病的主要因素之一，认为“风盛痰阻，气道挛急”既是哮喘发作的病因又是其发病之结果，“风盛痰阻，气道挛急”贯穿于哮喘的发作期、缓解期、稳定期，这与哮喘气道高反应性高度一致，与气道高反应密切相关。基于此本课题组进行动物实验，探索了祛风解痉方药对哮喘小鼠γδT淋巴细胞的影响[7]，现汇报如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 6～8周龄雄性Balb/c小鼠，动物体质量（35.0±3.0）g左右，清洁级，温度18～22 ℃，湿度50%～60%，光照12 h/12 h，购自湖北省动物实验中心（生产许可证：31162040001417），动物合格证号SYXK（鄂）2013-0069。

1.1.2 药物 祛风解痉方：炙麻黄9 g、杏仁10 g、防风10 g、地龙12 g、蝉蜕10 g、柴胡9 g、苍耳子6 g、乌梅6 g、陈皮10 g、半夏9 g、茯苓12 g、甘草6 g（中国中医科学院西苑医院中药房）;醋酸泼尼松片（天津力生制药股份有限公司，批号：1709111）。

1.1.3 试剂与仪器 卵清蛋白（OVA）（Sigma，美国，货号：A5503-1G）;氢氧化铝（Al（OH）3（Sigma，美国，货号：V900163-500G）;苏木素（福州迈新生物，货号：CTS-1099）;伊红（北京索莱宝，货号：G1100）;唑来膦酸（上海Aladdin，Z129382）;CCK8反应液（上海碧云天，货号：C0038）;IL-2（北京Solarbio，货号：P00198）;IL-5（联科生物，美国，货号：EK2051）;IL-13（联科生物，美国，货号：EK2131/2）;IL-10（联科生物，美国，货号：EK2101/2）;TGF-β（博士德生物，美国，货号：EK0515）;IFN-γ（联科生物，美国，货号：EK2801/2）;酶标仪（Multiskan MK3，美國，型号：Thermo Scientific）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 按照随机数字表将30只小鼠分为6组;空白对照组（不造模，给予等体积生理盐水，灌服，n=5）;模型组对照组（造模后，给予等体积生理盐水，灌服，n=5）;模型组对照组（造模后，给予等体积生理盐水，灌服，n=5）;祛风解痉方低剂量组（造模后，给予1倍剂量中药，0.59 g/d，灌服，n=5）;祛风解痉方中剂量组（造模后，给予2倍剂量中药，1.18 g/d，灌服，n=5）;祛风解痉方高剂量组（造模后，给予4倍剂量中药，2.36 g/d，灌服，n=5）;阳性对照组（造模后，给予1倍剂量醋酸泼尼松片，0.27 mg/d，灌服，n=5）。在无菌环境中饲养适应1周后，进行第一次致敏，腹腔内注射20 μg OVA和2 mg Al（OH）3;第2、3周后进行第2、3次致敏，腹腔内注射10 μg OVA和1 mg Al（OH）3;第5周开始每天用等量的PBS配制的5%OVA 40～50 min滴鼻处理。正常对照组用生理盐水致敏，滴鼻处理用等量的PBS，连续7 d后评估模型是否成功。

1.2.2 给药方法 祛风解痉方按人体每日用药量的1倍，2倍，4倍剂量给药。醋酸泼尼松片（5 mg/片），成年10片/d，给药量按照人与小鼠体表面积换算方式计算，按人体每天用药量的1倍量给药。模型建立后，第2天开始灌胃给药干预，饲料正常给予。给药14 d。

1.2.3 检测指标与方法 肺气道组织γδT细胞的分离纯化及扩增：小鼠麻醉处死后，将各组小鼠肺组织用无菌手术刀取出，切碎并用collgenase消化得到的细胞，用抗TCRγδ磁珠分选γδ T细胞及检测其浓度。分离纯化的γδ T细胞加入50 mL培养瓶中，加入含10%血清浓度为100 U/mL双抗RPMI-1640培养基3 mL，再加IL-2（终浓度为200 IU/mL）、唑来膦酸（终浓度为300 pg/mL），置于CO2浓度为5%，温度为37 ℃恒温箱中培养，培养9～12 d，其中每3 d换1次液，调整细胞浓度为106个/mL。CCK-8检测γδT细胞的增殖活性：对各组小鼠肺组织通过分选得到γδT细胞，取扩增10天细胞，CCK-8检测分选纯化后γδT细胞的增殖活性。接种培养10 d的各组肺气道组织γδT细胞，向每孔加入CCK8反应液10 μL，接着将培养板置于37 ℃，5% CO2条件下培养箱内孵育4 h。然后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。ELISA法测定γδT细胞：分泌的细胞因子浓度按照各指标试剂盒说明书（IL-5、IL-13、IL-10、TGF-β、EK0515、IFN-γ）的操作步骤进行标准品的稀释和加样。将测样品50 μL加入酶标包被板上待测样品孔中。将样品加于酶标板孔底部后晃动混匀，晃动时不要触及孔壁。封板后放置于温度为37 ℃的温箱中温育30 min。温育30 min后揭掉封板膜去液体甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，用上面相同的方法重复5次后拍干。每孔加入酶标试剂50 μL，温育30 min后洗涤。每孔依次入显色剂A 50 μL、B 50 μL，小心晃动混匀，在37 ℃避光条件下显色15 min后加终止液50 μL终止反应，当蓝色立转黄色时以空白空调零，在15 min内采用450 nm波长依序测量各孔吸光度（OD值）。

1.3 统计学方法 采用SPSS Statistics 17.0统计软件进行数据分析，本试验数据检验为方差齐，正态分布，计量数据以均数±标准差（±s）表示，做单因素ANOVA-LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8检测γδT细胞的增殖活性 与正常对照组比较，哮喘模型小鼠的γδT细胞的细胞活性显著增强。与哮喘模型组比较，祛风解痉方低剂量组的γδT细胞的细胞活性差异无统计学意义，而祛风解痉方中剂量组、祛风解痉方高剂量组以及阳性药物组的γδT细胞的细胞活性显著降低。见图1、图2。

2.2 ELISA法测定γδT细胞分泌的细胞因子浓度  取各组扩增10天γδT细胞，ELISA测定γδT细胞培养上清中IL-5、IL-13、IL-10、TGF-β、IFN-γ浓度。结果如图3及表1所示，与空白对照组比较，模型对照组的IL-5、IL-13、TGF-β水平上升。与模型对照组比较，祛风解痉方低剂量组的IL-5、IL-13、TGF-β水平差异无统计学意义（P>0.05），而祛风解痉方中剂量组、祛风解痉方高剂量组以及醋酸泼尼松片组在治疗后IL-5、IL-13、TGF-β的水平均显著降低（P<0.05）。与空白对照组比较，模型对照组IL-10、IFN-γ水平降低。与模型对照组比较，治疗后IL-10、IFN-γ水平上升，祛风解痉方低剂量组的IL-10、IFN-γ水平差异无统计学意义（P>0.05），而祛风解痉方中剂量组、祛风解痉方高剂量组以及醋酸泼尼松片组在治疗后IL-10、IFN-γ的水平均显著升高（P<0.05）。

3 讨论

中医学认为哮喘的主要病理机制为痰阻气道、肺失宣降、风盛痰阻、气道挛急等，现代医学认为哮喘的发病机制有气道炎性反应、变态反应、气道高反应性和神经因素等[5]。气道高反应性是一种反映哮喘患者气道功能异常状态的关键指标之一，在哮喘诊断及哮喘患者的病情和预后评估中具有重有意义，指气道对刺激物的反应性增高，气道出现支气管平滑肌收缩、黏液分泌增多及免疫炎性递质释放，气道阻力上升和肺通气功能下降[6]。β2激动剂与糖皮质激素是控制哮喘主要的药物，长期使用这些药物后部分患者出现激素抵抗，疗效下降，不能很好控制症状[12]。祛风解痉方是根据哮喘气道高反应性的病因病机“风盛痰阻，气道挛急”组成。炙麻黄为君，宣肺平喘。麻黄碱可松弛支气管平滑肌，麻黄提取物对机械刺激引起的咳嗽有明显的镇咳效果[13]。杏仁、防风、柴胡、地龙、蝉蜕为臣药，杏仁止咳平喘，苦杏仁苷对呼吸中枢呈抑制作用而达到镇咳平喘效应[14]。防风有抗炎、抗菌、抗过敏等药理作用[15]。地龙可通过其抗炎纤溶和抗组胺作用干预气道重构的信号通路和丝裂原活化蛋白激酶通路，对气道重构起到防治和逆转作用[16]。蝉蜕有抗炎、镇咳祛痰平喘、镇静止痛解痉、抗惊厥、抗凝等作用[17]。苍耳子、陈皮、半夏、茯苓为佐药，苍耳子具有抗过敏、抑菌、抗炎、镇痛等药理作用[18];茯苓、陈皮、半夏健脾燥湿祛痰，与麻黄、防风、柴胡起到宣发肺气畅通气道之功。甘草、乌梅为使药。甘草甘微溫，用以调和诸药，缓麻黄燥烈之性。乌梅敛肺、生津，与柴胡、防风配伍，调和阴阳。该方药能改善哮喘患者肺功能，降低易感性，降低呼吸道阻力，降低机体对过敏因素的应激反应，使肺小气道变为舒张，气道通顺，能明显缓解哮喘气道高反应性，明显改善哮喘气道高反应性患者临床症状，较好控制哮喘发作，改善哮喘气道阻塞，是防治哮喘患者气道高反性的有效方法[19]。

Lahn等[20]发现小鼠肺γδT细胞一方面下调过敏反应中的气道高反应性，另一方面募集嗜酸粒细胞，活化B细胞和T细胞，表现出2种不同的免疫效应。γδT细胞主要是募集B细胞到过敏反应局部影响其分泌Ig类型[21]。向小鼠注射γδT细胞的单克隆抗体导致气道高反应性-哮喘的发生[20]。因此，γδT细胞通过影响Th1/Th2应答平衡左右哮喘气道高反应性的发生发展。支气管哮喘还表现为气道慢性炎性反应，T淋巴细胞在哮喘炎性反应病理过程也起关键调节作用。γδT细胞是T淋巴细胞的一种，有研究显示γδT细胞具有促进气道炎性反应的作用[22]。本研究显示，与正常对照组比较，哮喘模型组γδT细胞的细胞活性显著增强，表明哮喘模型鼠肺组织的炎性反应加重。祛风解痉方中剂量组、祛风解痉方高剂量组及阳性药物组的γδT细胞的细胞活性显著减弱，表明中药治疗和阳性药物治疗可以显著缓解哮喘模型小鼠肺组织的炎性反应，具有一定的治疗效果。

哮喘主要特点为慢性气道炎性反应及气道高反应性，其发生发展的关键为Th1/Th2失衡，众多细胞和因子影响着Th1/Th2平衡。研究发现细胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-25等高表达可引起哮喘患者气道高反应性。IL-4和IL-13促进IgE高表达，IL-5、GM-CSF增强嗜酸性粒细胞增殖、活化、聚集，IL-13还直接增加气道黏膜分泌，IFN-γ和TNF-β等引发细胞免疫，同时IFN-γ可抑制IL-4及下调IgE的合成。我们的研究结果表明祛风解痉方中剂量组、祛风解痉方高剂量组在治疗后IL-5、IL-13、TGF-β的水平均显著降低，而IL-10、IFN-γ的水平均显著升高。因此，祛风解痉方可缓解哮喘模型小鼠肺组织的炎性细胞浸润情况，且祛风解痉方高剂量组的治疗效果最明显。

综上所述，祛风解痉方通过抑制γδT细胞的活性，降低γδT细胞分泌的细胞因子IL-5、IL-13、TGF-β表达水平，调高IL-10、IFN-γ的表达水平抑制气道炎性反应，改善哮喘模型小鼠的气道高反应性，其中高剂量中药对于哮喘模型小鼠具有良好的治疗效果。

参考文献

[1]Lu H，Li DJ，Jin LP.γδT Cells and Related Diseases[J].Am J Reprod Immunol，2016，75（6）：609-618.

[2]Bonneville M，O′Brien RL，Born WK.Gammadelta T cell effector functions：a blend of innate programming and acquired plasticity[J].Nat Rev Immunol，2010，10（7）：467-478.

[3]Brannan JD.Bronchial hyperresponsiveness in the assessment of asthma control：Airway hyperresponsiveness in asthma：its measurement and clinical significance[J].Chest，2010，138（2）：11S-17S.

[4]Kiyomi K，Terrence F M，Wendy L H.Epithelial and mucosal γδTcells[J].Curr Opin Immunol，2006，18（5）：534-538.

[5]Kabelitz D，Marischen L，Oberg HH，et al.Epithelial defence by gamma delta T cells[J].Int Arch Allergy Immunol，2005，137（1）：73-81.

[6]Wesch D，Peters C，Oberg HH，et al.Modulation of γδ T cell responses by TLR ligands[J].Cell Mol Life Sci，2011，68（14）：2357-2370.

[7]樊长征，裴玉蓁，张文江，等.风邪恋肺在支气管哮喘慢性持续期中的认识和临床运用[J].中国医药导报，2016，13（1）：102-105.

[8]Hahn YS，Taube C，Jin N，et al.Different potentials of gamma delta T cell subsets in regulating airway responsiveness：V gamma 1+ cells，but not V gamma 4+ cells，promote airway hyperreactivity，Th2 cytokines，and airway inflammation[J].J Immunol，2004，172（5）：2894-2902.

[9]Hahn YS，Ji XY，Woo SI，et al.Vγ1+ γδ T cells reduce IL-10-producing CD4+CD25+ T cells in the lung of ovalbumin-sensitized and challenged mice[J].Immunol Lett，2008，121（2）：87-92.

[10]Cook L，Miyahara N，Jin N，et al.Evidence that CD8+ dendritic cells enable the development of gammadelta T cells that modulate airway hyperresponsiveness[J].J Immunol，2008，181（1）：309-319.

[11]Nawijn MC，Motta AC，Gras R，et al.TLR-2 activation induces regulatory T cells and long-term suppression of asthma manifestations in mice[J].PLoS One，2013，8（2）：e55307.

[12]陈海华，王瑾，庄兰妹，等.吸入糖皮质激素联合长效β2激动剂与长效抗胆碱药物序贯治疗哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠综合征的疗效研究[J].山西医药杂志，2018，47（24）：2943-2945.

[13]黄玲，王艳宁，吴曙粤.中药麻黄药理作用研究进展[J].中外医疗，2018，37（7）：195-198.

[14]时登龙，刘代缓，曹喆，等.苦杏仁药理作用及炮制工艺研究进展[J].亚太传统医药，2018，14（12）：106-109.

[15]辛国，李鑫，黄晓巍.防风化学成分及药理作用[J].吉林中医药，2018，38（11）：1323-1325.

[16]张秋凤，李薇，吴晓东.气道重构的发病机制与地龙的药理作用[J].医学综述，2018，24（6）：1115-1120.

[17]赵子佳，周桂荣，王玉，等.蝉蜕的化学成分及药理作用研究[J].吉林中医药，2017，37（5）：491-493.

[18]陈海鹏，曾春晖，杨柯.苍耳子炮制现代研究进展[J].亚太传统医药，2017，13（18）：57-59.

[19]樊长征，裴玉蓁，丛晓东，等.祛风解痉方药对支气管哮喘患者气道高反应性的影响[J].中医杂志，2018，59（24）：2107-2110.

[20]Lahn M，Kanehiro A，Takeda K，et al.gammadelta T cells as regulators of airway hyperresponsiveness[J].Int Arch Allergy Immunol，2001，125（3）：203-210.

[21]Svensson L，Lilliehk B，Larsson R，et al.gammadelta T cells contribute to the systemic immunoglobulin E response and local B-cell reactivity in allergic eosinophilic airway inflammation[J].Immunology，2003，108（1）：98-108.

[22]魯玉敏.支气管哮喘急性发作期儿童25-羟维生素D_3水平与细胞免疫功能的关系[J].中国妇幼保健，2019，34（4）：843-845.

（2019-04-26收稿 责任编辑：王明）

基金项目：北京自然科学基金面上项目（7172190）——祛风解痉中药调节γδT细胞抑制哮喘小鼠气道高反应性的机制

作者简介：樊长征（1979.03—），男，博士，副主任医师，研究方向：中医药防治肺系疾病研究，Tel：（010）2835377，E-mail：faanchzh@163.com