芹菜素对深II度烧伤创面氧化应激和炎症反应的影响及机制研究

童海东，陈 骅

(中国人民武装警察部队海警总队医院烧伤科·浙江 嘉兴 314000)

烧伤包括火焰、热蒸汽烧伤以及电烧伤、化学品烧伤，具有较高的致残、致死率。深II度烧伤在临床上较为多见，并且治疗结局变数较大。病理生理学研究发现，创面局部血供、氧供不足而诱发氧化应激和炎症反应是影响创面愈合的关键因素[1-2]，为新型烧伤治疗药物开发提供了靶点。芹菜素(Apigenin，APG)是广泛存在于蔬菜和水果中的一种黄酮类化合物，以芹菜中含量最高，具有抑制炎症反应、降低氧化应激损伤的药理学作用[3-4]。本研究旨在探讨APG对深II度烧伤创面氧化应激和炎症的作用及其机制。

1 材料

1.1 实验动物 50只清洁级SD大鼠，雌雄不限，体质量200 g～240 g，由河北省实验动物中心提供[SCXK(冀)2018-004]。饲养环境：室温(25±1)℃、相对湿度(60±5)%、光照黑暗各12 h交替。

1.2 药物与试剂 APG：陕西慧科植物开发有限公司，纯度≥98%；乳酸钠林格注射液：石家庄四药有限公司。TUNEL试剂盒和MDA、SOD、GSH-Px、MPO试剂盒：南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司；磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、NF-κB抗体和DAB免疫组化染色试剂盒：北京博奥森生物科技有限公司。

1.3 实验仪器 YLS-5Q型烫伤仪：天津科技发展有限公司；RM2235 型石蜡切片机：德国Leica公司；SE300型电泳仪和TE22型转膜仪：美国Hoefer公司；Muhiskan FC型酶标仪：美国Ameritech公司；UV762型紫外-可见分光光度计：上海楚定分析仪器有限公司；CKX41型光学显微镜：日本Olympus公司。

2 实验方法

2.1 动物分组、模型制备与给药 将50只大鼠随机分为假烧伤组，模型组，APG低、中、高剂量[12.5、25.0、50.0 mg/(kg·d)]组，各10只；实验前12 h禁食水。深II度烧伤大鼠模型制备参照文献[5]：实施麻醉，剃除背部毛发后通过硫化钠溶液(浓度8%)脱毛，根据公式S=K·W2/3[S为体表面积(cm2)、W为体质量(g)、K=0.091]计算体表面积[6]；烫伤仪于背部脱毛处皮肤加压0.03 MPa、温度106 ℃持续5 s制备深II度30%烧伤大鼠模型，然后立即腹腔注射5 mL乳酸钠林格溶液以抗休克。成模标准：真皮层内细胞部分坏死，毛囊和汗腺等皮肤附件组织结构完整。假烧伤组大鼠脱毛后即腹腔注射5 mL乳酸钠林格溶液。APG低、中、高剂量组分别腹腔注射浓度6.25、12.5、25.0 g/L芹菜素溶液(注射剂量2 mL/kg)，假烧伤组和模型组大鼠2 mL/kg同步给予生理盐水，1次/d，连续给药14 d。

2.2 观察指标

2.2.1 烧伤创面愈合率检测及含水量计算 末次给药24 h后，通过图像分析系统计算创面面积，计算公式：创面愈合率(%)=(1-未愈创面面积/初始创面面积)×100%。然后，腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后，经腹主动脉取血并1 500 r/min离心10 min取血清，-20 ℃保存备检；颈椎脱臼处死大鼠后，取皮肤创面组织并用生理盐水冲洗干净。取每只大鼠部分皮肤创面组织称重记为W1，烘烤至恒重后再次称重记为W2，烧伤创面含水量计算公式：含水量(%)= [(W1-W2)/W1]×100%。

2.2.2 创面组织病理学观察和细胞凋亡观察 取每只大鼠部分皮肤创面组织，经多聚甲醛溶液(浓度为4%)固定、包埋、切片后，部分切片行HE染色，封片后通过显微镜观察创面组织病理学改变。剩余切片行TUNEL染色，封片后通过显微镜观察创面细胞凋亡状况；凋亡指数(AI)计算公式：AI(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%

2.2.3 创面组织氧化应激指标检测 取每只大鼠剩余的皮肤创面组织，剪碎后加入适量冷裂解液、冰上静置30 min后研磨匀浆，1 500 r/min离心10 min后取上清液，按照各试剂盒操作说明，通过紫外-可见分光光度计检测MDA含量和SOD、GSH-Px、MPO活性。

2.2.4 创面组织p-Akt、Nrf2、NF-κB蛋白表达的Western Blot检测 取2.2.4制备的各组大鼠创面组织匀浆液，12 000 r/min离心20 min(恒低温4℃)取上清液，检测蛋白浓度后上样，经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭后滴加目标蛋白和β-actin一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h后，DAB试剂盒显影检测，以目的条带与β-actin(内参)条带灰度值比值进行半定量分析。

2.2.5 血清炎性因子检测 取2.2.1制备的各组大鼠血清，采用ELISA法，通过酶标仪检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

3 结果

3.1 各组大鼠创面愈合率和含水量比较 见表1。

表1 各组大鼠创面愈合率和含水量的比较

3.2 各组大鼠创面组织病理学观察结果 假烧伤组大鼠创面皮肤组织未见异常；模型组创面真皮下层组织水肿、胶原纤维断裂和炎性细胞浸润等病理学改变；APG低、中、高剂量组上述病理学改变呈不同程度改善，其中APG高剂量组真皮下层组织水肿明显减轻、汗腺和皮脂腺结构完整、炎性细胞明显减少、皮粒可见。见图1。

图1 各组大鼠创面组织病理学改变(HE，×100)

3.3 各组大鼠创面细胞凋亡比较 假烧伤组可见少量凋亡细胞；与假烧伤组比较，模型组凋亡细胞数量明显增多，AI显著升高[(52.03±8.47)%VS(4.15±1.36)%，P<0.01]；与模型组比较，APG低、中、高剂量组凋亡细胞数量明显减少，AI显著降低[(44.17±6.82)%、(31.59±4.93)%、(24.60±4.48)%VS(52.03±8.47)%，P<0.05或P<0.01]。见图2。

图2 各组大鼠创面细胞凋亡检测(TUNEL，×200)

3.4 各组大鼠创面组织MDA含量和SOD、GSH-Px、MPO活性比较 见表2。

表2 各组大鼠创面组织MDA含量和SOD、GSH-Px、MPO活性比较

3.5 各组大鼠创面组织p-Akt、Nrf2、NF-κB蛋白表达比较 见图3和表3。

图3 各组大鼠创面组织NF-κB、Nrf2、p-Akt蛋白表达

表3 各组大鼠创面组织p-Akt、Nrf2、NF-κB蛋白表达比较

3.6 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较 见表4。

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较

4 讨论

根据“三度四分法”分级，深II度烧伤伤及真皮网层，但毛囊、汗腺等皮肤附件组织并未完全损伤，如果处理不及时或治疗不当则可能诱发感染，从而导致创面加深，增加治疗难度和死亡率[7]。APG是天然存在的一种具有多种生物学活性的黄酮类化合物，本研究发现，经APG治疗能够明显提高烧伤创面愈合率、降低创面组织含水量，减轻创面组织病变，降低创面细胞凋亡率，说明APG具有促进深II度烧伤创面愈合的作用。

烧伤具有较为复杂的病理机制，其中氧化应激和炎症反应在烧伤疾病进展过程中发挥着重要作用。王莹等[8]研究发现烧伤创面血管受损使血供、氧供不足，导致活性氧片段(ROS)过量生成进而引发创面组织水肿和炎症反应，阻滞修复细胞增殖而减缓创面愈合。巩文艺等[9]、刘驰星等[10]和王黎丽等[11]通过动物实验研究发现，通过药物抑制氧化应激和炎症反应能够减轻烧伤所致心、肺、肾脏损伤；SOD和GSH-Px是机体还原清除ROS的关键抗氧化酶，SOD和GSH-Px活性降低致使ROS不能及时被清除，ROS则将攻击生物膜、DNA、蛋白质等并生成具有生物毒性的MDA[12]。MPO是一种具有ROS清除作用的过氧化氢酶。烧伤将刺激创面组织大量释放炎性介质，其中TNF-α、IL-1β、IL-6不但能够引发炎症反应，并且做为炎症趋化因子能够诱导中性粒细胞合成与释放炎性介质而形成“炎症级联反应”，进一步加重创面损伤[13]。本研究发现，经APG治疗14d能够显著提高SOD、GSH-Px、MPO活性并降低MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量，提示APG具有抑制深II度烧伤创面氧化应激和炎症反应的作用。

Akt被诱导磷酸化(p-Akt)激活后，能够诱导下游基因Nrf2与抑制剂Keap1解离，并促进Nrf2核转位，进而诱导抗氧化酶(SOD、GSH-Px等)和血红素氧合酶1(HO-1)转录表达[14]，进而抑制氧化应激反应。HO-1对NF-κB活化具有抑制作用，而NF-κB能够诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性介质合成与释放，任国强等[15]研究发现抑制NF-κB表达能够明显抑制炎症反应。本研究发现，经APG治疗14d能够显著上调p-Akt、Nrf2蛋白表达并下调NF-κB表达，提示APG激活Akt/Nrf2通路和下调NF-κB表达可能是其抑制深II度烧伤创面氧化应激和炎症反应作用的重要机制。

综上所述，APG具有抑制氧化应激和炎症反应而促进深II度烧伤大鼠创面愈合的作用，作用机制可能与激活Akt/Nrf2通路、下调NF-κB表达有关。