LC-MS/MS法测定大鼠血浆中丹参酮IIA磺酸钠及其毒代动力学研究

王 芳，徐玲玲，刘爱明，逯海燕，刘小雨，陈 凯

（山东省药学科学院、山东省生物药物重点实验室，山东 济南 250101）

中药丹参中提取的丹参酮IIA具有改善心肌供血、保护心肌细胞、抗炎及抗氧化的药理作用，可用于治疗冠心病、脑卒中、心绞痛、急性心肌梗死等疾病，是临床上治疗心脑血管疾病的常用药[1-3]。但是丹参酮IIA因为水溶性差，胃肠道难吸收故而临床起效慢，后经磺化成盐合成丹参酮IIA磺酸钠，制成注射剂，解决了上述问题[4-7]。

近年对丹参酮IIA磺酸钠的研究较多[8-11]，多采用高效液相色谱法测定其制剂含量及药代动力学方面，目前尚未见报道LC-MS/MS方法测定其含量及相关的毒代动力学研究资料。本研究拟建立一种LC-MS/MS方法测定大鼠血浆中丹参酮IIA磺酸钠的浓度，并将其应用于注射用丹参酮IIA磺酸钠的毒代动力学研究，预测其在临床长期应用时的潜在风险。

1 材料

1.1 试剂

乙腈（色谱纯，批号：155174，Fisher scientific）；水（Advantage A10 Milli-Q超纯水机制备）；氯唑沙宗（批号：100364-201302，中国食品药品检定研究院）；丹参酮IIA磺酸钠（含量：99.1 %，自制），注射用丹参酮IIA磺酸钠（含量：98.9 %，自制）。

1.2 仪器

Agilent 1260-6430三重四极杆串联质谱仪（安捷伦科技有限公司）。AUW-120D型电子分析天平（岛津公司）；Eppendorf移液器（艾本德公司）；Advantage A10 Milli-Q超纯水机（默克化工技术有限公司）；Vortex Genius 3涡旋仪（广州仪科实验技术有限公司）；Z216MK 高速冷冻离心机（Hermle有限公司）。

1.3 试验动物

大鼠30只，体重170 ～220 g，年龄约6 ～8周，购买自北京维通利华实验动物有限公司[动物许可证号：SCXK（京）2012-0001]。

1.4 色谱条件

色谱柱为Inertsil ODS-SP色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），GL Sciences；流动相为水（A）与乙腈（B）；洗脱梯度为0～3 min，15 % B→95 % B；3～3.5 min，95 % B，3.5～3.51 min，95 % B→15 %B；3.51～5 min，15 % B；流速1.3 ml/min，柱温为40 ℃，进样量为5 μl，进样器温度8 ℃，分析时间为5 min，柱后采用1:4三通分流。

1.5 质谱条件

离子化方式：电喷雾-负离子；干燥气：N2；干燥气流速10 L/min，干燥气压力40 psi，干燥气温度350 ℃，毛细管电压4000 V。监测方式：MRM，丹参酮IIA磺酸钠定量离子对为m/z：373.1→357.0，内标氯唑沙宗定量离子对为m/z：168.0→132.0。

1.6 溶液配制

精密称取丹参酮IIA磺酸钠10 mg置入10 ml量瓶，乙腈溶解并稀释定容至刻度，配成质量浓度为1 mg/ml储备液。平行配制2份，两份储备液分别用乙腈稀释成为1，2.5，5，10，25，50，75，100 μg/ml标准曲线溶液及1，2，40和80 μg/ml质控溶液。储存于2～8 ℃冰箱。

精密称取10 mg氯唑沙宗置入100 ml量瓶，乙腈溶解并稀释定容至刻度，配成浓度为100 μg/ml内标储备液。移取1 ml置入1 L量瓶，乙腈溶解并稀释定容至刻度，配成浓度为100 ng/ml内标溶液。

1.7 样品处理

吸取“1.8”项采集的血浆样本20 μl，加入含氯唑沙宗100 ng/ml乙腈溶液580 μl，涡旋2 min混匀，13000 r/min离心5 min，取上清100 μl，水100 μl置于96孔板中涡旋10 min混匀后，进样检测。

1.8 毒代动力学

大鼠随机分成3组，每组10只，雌雄各半，低、中、高剂量组给药剂量分别10，20，40 mg/kg，给药方式为静脉推注，给药体积均为10 ml/（kg·d）-1，连续4周每天给药1次。采血日期为D1和D28，采血时间点：给药前（0 h）及给药后5，15，30 min及1，2，4，8，12 h。颈静脉取血0.2 ml，置入预涂肝素钠的离心管，8000 r/min离心5 min，取上层血浆，-65 ～-85 ℃保存。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性 分别取6个不同个体大鼠空白血浆，按“1.7”项操作（含氯唑沙宗100 ng/ml乙腈溶液改为纯乙腈），经分析，得空白血浆色谱图（见图1A）；将含250 ng/ml丹参酮IIA磺酸钠的血浆样本，依照“1.7”项操作（含氯唑沙宗100 ng/ml乙腈溶液改为纯乙腈），经分析，得丹参酮IIA磺酸钠色谱图（见图1B）；将空白血浆，依照“1.7”项操作，经分析，得内标色谱图（见图1C）；取给药后2 h的血浆样品20 μl，按“1.7”项操作，得血浆样品色谱图（见图1D）。6个不同个体空白基质在丹参酮IIA磺酸钠出峰位置均无响应，不干扰其定量。

图1 丹参酮IIA磺酸钠及内标代表性色谱图

2.1.2 残留 在标准曲线最高浓度样品（ULOQ）后，进样空白大鼠血浆样品，考察残留。ULOQ样品后进样的空白大鼠血浆样品中在丹参酮IIA磺酸钠出峰位置无响应，说明残留对丹参酮IIA磺酸钠准确定量无干扰。

2.1.3 标准曲线和定量下限 取标准曲线溶液，按照1:9比例，用空白大鼠血浆稀释得到100，250，500，1000，2500，5000，7500，10000 ng/ml血浆样本，按“1.7”项操作。以丹参酮IIA磺酸钠的浓度为横坐标（x），丹参酮IIA磺酸钠与内标氯唑沙宗的峰面积比值为纵坐标（y），用加权最小二乘法（权重为1/x2）进行回归运算。回归方程为y=0.044 457x+0.087 889，r=0.9932，表明丹参酮IIA磺酸钠在100 ～10000 ng/ml范围内线性关系良好。

取浓度为100 ng/ml血浆样本，按“1.7”项操作，平行测定6个样本。结果准确度为99.2 %，精密度用RSD表示为9.0 %，符合生物样本的检测要求。

2.1.4 准确度与精密度 用空白血浆将丹参酮IIA磺酸钠质控溶液稀释成定量下限（100 ng/ml）、低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）4个浓度的样本，按“1.7”项下依法操作，每一浓度6个平行样本，3个分析批分3天进行，以标准曲线算得待测分析物的浓度，并计算样本的批内、批间准确度和精密度。结果见表1，批内和批间准确度85 %～115 % ，精密度RSD不超过15 %。

表1 丹参酮IIA磺酸钠的批内、批间准确度与精密度

2.1.5 基质效应与回收率 为考察大鼠血浆中复杂基质对检测结果的影响，使用6批来自不同个体的提取后的空白大鼠血浆溶液稀释质控样本溶液至低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）得到含基质样本，使用乙腈稀释质控样本溶液至低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）得到纯溶液样本，通过计算计算经内标归一化的基质因子考察基质效应。比较准确度与精密度项下低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）血浆样本与纯溶液样本的峰面积考察回收率。结果见表2。

表2 基质效应与回收率

2.1.6 稳定性考察 用空白大鼠血浆将质控溶液稀释成低（200 ng/ml）、中（4000 ng/ml）、高（8000 ng/ml）3个浓度的样本，每个浓度6份。分别考察丹参酮IIA磺酸钠血浆样品室温放置5 h，-10～-30 ℃放置15 d、样品处理后进样器内8 ℃放置30 h及4个冷冻-解冻周期的稳定性。结果见表3，丹参酮IIA磺酸钠血浆样品在上述储存条件下均稳定。

表3 丹参酮IIA磺酸钠在不同条件下稳定性（n=6）

2.1.7 稀释可靠性 取1 mg/ml丹参酮IIA磺酸钠储备液用乙腈稀释至800 μg/ml，取20 μl，加入180 μl大鼠空白血浆，涡旋混匀，得80 μg/ml血浆样本。取10 μl该样本加大鼠空白血浆190 μl涡旋混匀稀释，平行6份，按“1.7”项操作。稀释20倍后，测量结果准确度为107.9 %，RSD为2.6 %，表明稀释20倍可靠。

2.2 毒代动力学

采用验证的LC-MS/MS法测定大鼠血浆中丹参酮IIA磺酸钠的浓度，以随行标准曲线计算血浆药物浓度，采用WinNonlin 6.3软件非房室模型计算主要毒代动力学参数Cmax、AUC0-t。结果见表4和图2。

图2 首次（A）、末次（B）给药后各组丹参酮IIA磺酸钠的平均血药浓度-时间曲线

表4 丹参酮IIA磺酸钠在大鼠体内的毒代动力学参数

3 讨论

注射用丹 参酮IIA磺酸钠在大鼠体内的毒代动力学研究尚未见报道，本研究建立了测定大鼠血浆中丹参酮IIA磺酸钠浓度的LC-MS/MS分析方法，该法重现性好、灵敏度高、简单快速，适用于检测大鼠血浆中丹参酮IIA磺酸钠的浓度。在方法开发过程中发现，进样溶剂组成对峰型有较大影响，故

采用有机溶剂蛋白沉淀后取上清加入等比例水，改善峰型。本试验在色谱柱后采用1:4三通分流减少进入质谱的流动相与不分流相比，样本响应重现性得到很大提升。

大鼠一日1次、连续28 d静脉注射丹参酮IIA磺酸钠，连续28天给药后，各剂量组雌雄大鼠体内丹参酮IIA磺酸钠暴露量较首次给药无明显升高，表明药物无蓄积；毒理学结果表明，除40 mg/kg组大鼠药后可见与受试物颜色相关的橙色尿液及稀便外，动物的体重、摄食量、临床病理学及组织病理学检查指标均未见异常改变，其最大未观察到损害作用剂量（NOAEL）为40 mg/kg。

综上所述，本研究开发的 LC-MS/MS 法符合生物样品分析的要求，可用于注射用丹参酮IIA磺酸钠毒代动力学研究，通过观察重复给予受试物后大鼠体内暴露量与给药剂量和时间关系，预测受试物在应用时的潜在风险，为其临床前研究奠定了基础[11-13]。