GC法同时测定丁细牙痛胶囊中4种成分的含量

2021-07-08陈进芳翁育才

食品与药品 2021年3期

陈进芳，翁育才

（海南医学院第二附属医院药学部，海南海口 570311）

丁细牙痛胶囊是由丁香叶和细辛2味药材组成，具有清热解毒，疏风止痛的功效，临床用于风火牙疼，牙龈肿胀，急性牙髓炎及急性根尖周炎的治疗[1]。作为国内首创根治牙病的国家三类新中药，现行质量标准含量控制仅采用专属性较差的紫外分光光度法测定丁香叶中原儿茶酸的含量[2]。现有药理研究发现，丁细牙痛胶囊发挥抗菌、抗炎、镇痛和中枢抑制作用的活性成分主要是挥发性成分[3-4]。查阅文献虽已有报道[5-6]采用气相色谱法（GC）测定丁细牙痛胶囊中甲基丁香酚和丁香酚的含量，但这些研究只针对一种活性挥发性成分的质量控制，难以全面整体评价丁细牙痛胶囊的质量特性[7]。鉴于此，为全面监测丁细牙痛胶囊的质量及保障其临床有效性，笔者选取方中挥发性成分为研究对象，同时测定丁香叶和细辛中丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚4种挥发性成分的含量，为该品种质量标准的提升提供参考。

1 仪器和试药

GC-2010 Plus型气相色谱仪（日本Shimadzu公司，包括2010 Plus型氢火焰离子检测器，WBI-2010 Plus型进样口，AOC-201+S型自动进样器，Lab Solutions 5.87 色谱工作站）；梅特勒-托利多MS105DU/A型电子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；UPT-I-10T型优普系列超纯水机（成都超纯科技有限公司）；KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司，功率500 W，频率50 kHz）。

丁香酚对照品（批号：110725-201917，含量以99.1 %计），甲基丁香酚对照品（批号：111642-200301，含量以100.0 %计）购自中国食品药品检定研究院；异丁香酚对照品（批号：Y-147-190426，纯度：≥98.00 %），黄樟醚对照品（批号：Y-226-1806176，纯度：≥98.00 %）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙酸乙酯为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

市售丁细牙痛胶囊4批，规格：0.45 g/粒，购自深圳市泰康制药有限公司（批号：20190619，20190923，20191107，20200409）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[8-10]

色谱柱：HP-1301毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；程序升温：初始温度120 ℃，以6 ℃/min升温至180 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升温至 250 ℃，保持12 min；检测器：氢火焰离子检测器（FID）；检测器温度：260 ℃；进样口温度：200 ℃；载气：高纯氮气（纯度：99.999 %）；流速：2 ml/min；进样量：1 μl；进样分流比：40:1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液分别取丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚对照品各适量，精密称定，加正己烷制成每1 ml分别含丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚3.857，1.794，0.8591，1.006 mg的混合对照品溶液。冰箱冷藏保存备用。

2.2.2 供试品溶液取丁细牙痛胶囊10粒，傾出内容物，研匀，取约1.0 g，精密称定，置入具塞锥形瓶，精密加入正己烷50 ml，密塞，称定重量，浸渍过夜后置入冰浴中超声处理（400 W，40 kHz）40 min，再称重并用正己烷补足减失的重量，摇匀，离心，精密量取上清10 ml，减压浓缩至约0.5 ml，用正己烷转移至2 ml量瓶，加正己烷至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液丁细牙痛胶囊处方分别去除丁香叶、细辛后，按处方比例及制备工艺制得阴性对照，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1可知，4种化学成分均能达到基线分离，理论板数均大于5500，分离度均大于1.5。

图 1 气相色谱图

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml置入25 ml棕色量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液，精密吸取上述系列混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。以质量浓度为横坐标（x，μg/ml），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，绘制各组分标准曲线，计算回归方程和相关系数，见表1。结果表明：丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚在其对应的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；将对照品溶液逐级稀释后，以信噪比（S/N）约为3.0 时的浓度为各成分的检测限（LOD）。

表1 线性关系考察结果（n=6）

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液1 μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定5次，记录峰面积。结果丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚峰面积的RSD分别为 0.59 %，0.82 %，0.65 %，0.47 %（n=5），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：20191107），分别于制备后在室温下放置0，4，8，12，18，24 h，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚峰面积的RSD分别为0.74 %，0.82 %，0.69 %，0.91 %（n=6），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取丁细牙痛胶囊（批号：20191107）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚的平均含量分别为5.362，2.817，1.533，0.9406 mg/g，RSD分别0.77 %，0.95 %，0.89 %，1.01 %（n=6），表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的丁细牙痛胶囊（批号：20191107）6份，每份约0.5 g，精密称定，分别置入具塞锥形瓶中，精密加入丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚混合对照品溶液（浓度分别为3.857，1.794，0.8591，1.006 mg/ml）0.75 ml，按“2.2.2”项下供试品溶液方法制备，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚的平均加样回收率分别为99.87 %，99.12 %，98.84 %，98.80 %，RSD分别为0.61 %，0.65 %，0.35 %，0.96 %（n=6），表明该方法准确可靠（见表2）。

表2 四个成分的加样回收率试验结果（n=6）

2.9 耐用性试验

取丁细牙痛胶囊（批号：20191107）适量，按“2.2.2”项下供试品溶液方法制备，分别设置不同品牌毛细管柱、进样口温度、检测器温度、流速参数，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图并按标准曲线法计算样品含量，结果见表3。由表3可见，不同品牌、不同柱内径、不同膜厚度的色谱柱，不同进样口温度，不同检测器温度，不同流速对含量测定结果影响较小，表示本方法耐用性良好。

表3 耐用性试验结果

2.10 样品测定

分别取不同批次丁细牙痛胶囊，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚的峰面积，代入“2.4”项下回归方程计算丁细牙痛胶囊中上述4种成分含量。结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果/mg·g-1（n=3）

3 讨论

3.1 测定成分的选择

丁细牙痛胶囊中的丁香叶和细辛均含有挥发性成分，首载于《新华本草纲要》的丁香叶，作为该方的君药，未载入药典，主要来源于木犀科丁香属植物紫丁香、朝鲜丁香或洋丁香的干燥叶，含有大量的挥发油、黄酮类、环烯醚萜类及苷类等成分，有较强的抗菌消炎及清除自由基功效，主要用于治疗消化系统疾病及口腔护理[11-12]，其中挥发油类成分包括主要有抗菌、解热、促进透皮吸收等多种药理活性的丁香酚，有镇痛抗炎、抗氧化损伤等药理活性的甲基丁香酚和异丁香酚[13-14]。临床常用于治疗风寒头痛、牙痛等症的细辛，主要活性部位为挥发油，黄樟醚和甲基丁香酚是细辛中含量最高的成分, 具有显著的镇痛、抗炎等作用[15-16]。故笔者选择对丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚4种挥发性成分进行含量测定。

3.2 提取工艺的选择

在制备供试品溶液时，本实验考察了提取方法（超声、振摇、挥发油提取）、提取溶剂种类（乙酸乙酯、正己烷、甲醇）、提取时间（30，40，50 min）、超声功率（300，400，500 W）及超声温度（冰浴、室温），结果表明，在以正己烷浸渍过夜后置入冰浴中超声处理的方法，操作简便，4种挥发法性成分化学结构不会被破坏，提取率最高，杂质峰干扰较少；超声功率400 W或 500 W、提取时间40 min 或 50 min 时，丁香酚、甲基丁香酚、黄樟醚及异丁香酚各挥发性成分含有量均无明显差异。为简化操作，最终确定为“2.2.2”项下方法。