透明质酸酶对马鹿精子体外获能影响的研究

孙佳阳，崔 凯，马杨君，邹 琦，李和平*

（1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨 150040；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）

哺乳动物精子受精前须在雌性动物生殖道内进行获能，然后才能获得受精能力，即精子获能(capacitation)[1-2]。哺乳动物精子获能现象的发现是动物体外受精研究的里程碑[2]。因而，诱导精子体外获能技术是体外受精必须首先解决的关键技术之一。

透明质酸酶（hyaluronidase）是精子细胞顶体内含有的一种溶酶体酶，它参与溶解含有透明质酸的卵丘，在精子受精过程中起着重要作用[3]。精子顶体位于精子头部前端，覆盖在精子核前面，是外包有单位膜的囊状结构[3]。顶体内含有多种蛋白水解酶、磷酸脂酶等，透明质酸酶便是其中的一种重要酶。当精子获能、发生顶体反应时，顶体释放使精子可以穿过卵细胞的放射冠、溶解含有透明质酸的卵丘，使卵泡周围的颗粒细胞分散，便于精子进入卵子内[2-4]。

马鹿是目前我国人工养殖的主要特种畜禽之一，探究其受精生物学机制的基础研究及其相关的体外受精技术具有重要科学意义与实践价值。但目前有关透明质酸酶对马鹿精子体外获能的研究很少。试验采集马鹿精子，开展了透明质酸酶对马鹿精子体外获能影响的研究，以期为马鹿体外受精实践提供基础的数据参考。

1 材料

1.1 精液来源

成年健康雄性种马鹿1头，来自黑龙江省农垦科学院哈尔滨特产所鹿场。以人工采精的方法采得马鹿新鲜精液，用无卵黄精液稀释液（Andromed®）稀释后，在0～4 ℃保存（不超过5 d）。

1.2 试剂与精子体外获能培养液

透明质酸酶（hyaluronidase），购自SIGMA 公司；其他试剂及精子体外获能培养液的配制，参照参考文献[5]。

2 方法

2.1 试验方案

采用上浮法（sperm swam-up），在精子获能液透明质酸BO（BO solution）/TALP（台式液，Tyrode's albumin lactate pyruvate solution）基础液+6 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）+10 μg/mL 肝素中，分别添加透明质酸酶至终浓度为0（对照组），0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 g/L 的浓度梯度，处理30 min，观测精子活力、弯尾率以评价体外获能效果；并随之制作培养滴于培养箱中培养2，4，6，8 h镜检，记录精子活率。试验组别设置见表1。

表1 组别设置

2.2 精子活力、活率、弯尾率的检测

为评价透明质酸酶对马鹿精子体外获能效果的影响，在显微镜下观测直线运动精子数、弯尾精子数、活精子数和精子总数，计算精子活力、活率、弯尾率以评价精子质量。直线运动精子数占精子总数百分比为精子活力，活精子数占精子总数百分比为精子活率，弯尾精子数占精子总数百分比为精子弯尾率。精子活力、活率、弯尾率的检测与计算参照参考文献[6-7]。

检测结果以平均值±标准差表示，用t检验对数据进行统计分析。

3 结果

3.1 透明质酸酶对精子获能的影响

3.1.1 BO 液中不同浓度透明质酸酶对精子获能的作用 添加透明质酸酶0.50，0.75，1.00，1.25 g/L组精子活力均与对照组差异不显著（P＞0.05），而添加透明质酸酶1.50 g/L 组的精子活力则显著低于对照组（P＜0.05）。说明精子活力随着透明质酸酶添加浓度的增加有先增加后降低的趋势。添加透明质酸酶0.75，1.00，1.25 g/L 组精子弯尾率较高，显著高于其他组（P＜0.05），且添加透明质酸酶1.00 g/L组的弯尾率最高，见表2。

表2 BO液中不同浓度透明质酸酶对精子体外获能的影响 %

3.1.2 TALP 液中不同浓度透明质酸酶对精子获能的作用 透明质酸酶0.50，0.75，1.00 g/L组精子活力均与对照组差异不显著（P＞0.05），而透明质酸酶1.25，1.50 g/L 组精子活力显著低于对照组（P＜0.05）。说明精子活力随着透明质酸酶添加浓度的增加呈降低趋势。透明质酸酶1.00 g/L 组弯尾率最高，极显著高于对照组（P＜0.01）；透明质酸酶0.75 ，1.25 g/L 组弯尾率显著高于对照组（P＜0.05），见表3。

表3 TALP液中不同浓度透明质酸酶对精子体外获能的影响 %

3.2 时间与透明质酸对精子活率的影响

3.2.1 BO 液中不同浓度透明质酸酶对精子活率的影响 于2，4，6，8 h后镜检、记录精子活率的结果显示，添加不同浓度透明质酸酶对改善精子活率、延缓精子活率降低没有效果，见表4。

表4 BO液中不同浓度透明质酸酶对精子活率的影响 %

3.2.2 TALP 液中不同浓度透明质酸对精子活率的影响 于2，4，6，8 h 镜检记录精子活率的结果显示，添加不同浓度透明质酸酶对精子活率的影响效果、趋势与在BO 液中的效果相似，即添加不同浓度透明质酸酶对改善精子活率、延缓精子活率降低没有效果，见表5。

表5 TALP液中透明质酸酶对精子活率的影响 %

4 讨论

在2020 年5 月国家公布的《国家畜禽遗传资源目录》中的人工养殖的马鹿是主要特种畜禽之一，对其繁殖技术的研究与实践无疑具有重要的意义，其中体外受精是实现良种快繁的重要技术领域之一。

精子获能是哺乳动物精子受精之前必须经历、不可或缺的一个生理阶段[2]，精子获能是精子进入超激活状态，涉及精子质膜的脂质组成变化、通透性与流动性提高、内外离子变化等反应[8]。因而在进行体外受精研究与实践过程中，毫无疑问精子体外获能就是体外受精的关键前提技术。鹿是重要的哺乳类经济动物，对其开展体外受精等技术的研究同样具有重要科学意义。但目前对于鹿精子体外获能、体外受精的研究仍处于起步阶段，诸多技术难点有待突破。前期的相关研究已经表明，以TALP、BO、高渗液（high ionic strength medium，HIS）和改良克-林二氏重碳酸盐溶液（modified Krebs - Ringer bicarbonate solution，mKRB）培养液为基础液均可使马鹿精子在体外获能，而且肝素、咖啡因等也能有效促进马鹿精子体外获能，并完成体外受精[9]。

透明质酸酶是一种能够降低体内透明质酸活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶[3]。透明质酸酶是位于精子原生质的水解酶，能够在受精过程中分解卵子的卵丘，具有水解透明质酸的作用，促使精子能够顺利地穿透卵丘，到达放射冠。透明质酸酶是顶体中固有成分，与受精过程中精子穿透卵子有关[3-4]。因此，在精子获能培养液中加入透明质酸酶可能有利于精子内透明质酸酶的释放，加快精子获能。对牛精子，不论是冻精还是反复洗涤的鲜精，透明质酸酶均能使其活性显著降低，在使用透明质酸酶后活性是否能恢复到生理值水平、达到改善受精的目的，是很值得探讨的问题[4-8]。而且透明质酸酶对精子获能的顶体反应有协助作用[2-4]。

为了探讨透明质酸酶对马鹿精子体外获能的诱导作用，本试验采用上浮法，在获能液BO/TALP基础液+6 mg/mL BSA+10 μg/mL 肝素中，分别添加透明质酸酶至终浓度为0，0.50 ，0.75，1.00，1.25，1.50 g/L，测定了精子活力、弯尾率、精子活率等参数指标，以此评价透明质酸酶对马鹿精子体外获能的影响。结果表明，在BO 或TALP 液中0.75～1.25 g/L透明质酸酶可提高马鹿精子体外获能水平，其适宜的透明质酸酶浓度为1.00 g/L，而在BO或TALP液中添加不同浓度透明质酸酶对改善精子活率、延缓精子活率降低则没有效果，为今后开展马鹿精子体外获能、体外受精等受精生物学相关技术研究提供数据依据。