Sirtuins在精子发生中的表达规律及调控机制研究进展

胡林林，张 青，廖碧云，余金梅，张丽军，洪齐富，雷小灿,3*

（1.右江民族医学院附属医院生殖中心，广西 百色 533000；2.遵义医科大学基础医学院，贵州遵义 563003；3.南华大学衡阳医学院，湖南 衡阳 421001）

精子的发生高度依赖于糖酵解代谢产生的能量，这个复杂的过程被称为类似肿瘤细胞的Warburg效应，此过程受到代谢传感器（如Sirtuins）的调控。Sirtuins 是一类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性脱乙酰基酶，具有高度的保守性，在哺乳动物中主要有7 种，包括SIRT1～SIRT7[1]。Sirtuins 具有独特的底物特异性和亚细胞定位，参与了多种生物学过程，如基因沉默、细胞周期的调控、代谢、细胞凋亡、癌症等过程，并与精子发生过程密切相关[2]。研究发现，Sirtuins在睾丸组织中高表达，Sirtuins 的活性与细胞能量状态以及NAD+浓度和NAD+与NADH 水平之间的波动密切相关，细胞中NADH 的水平主要取决于丙酮酸的去向，以上三个特性决定了Sirtuins在调控睾丸能量代谢的过程中发挥着重要作用[3]，暗示了这些蛋白质对于维持睾丸正常生精功能不可或缺。文章着重从Sirtuins在精子发生过程中的表达规律、功能及相关的调控机制进行综述。

1 Sirtuins家族分子结构

Sirtuins家族分子的催化核心区域具有高度的相似性：有大小两个基本结构域，每个结构域由275 个氨基酸残基组成，大的结构域由Rossmann折叠形成，具有较高的保守性，小的结构域含有一个锌指结构[4-5]。研究发现，哺乳动物Sirtuins家族7 个亚型（SIRT1～SIRT7）的亚细胞定位不同，其中SIRT2 位于细胞质中，SIRT1、SIRT6 和SIRT7 在细胞核中，SIRT3、SIRT4和SIRT5主要分布在线粒体中[6]。在Sirtuins家族中，SIRT1是研究最多的一种酶，广泛存在于机体的体细胞和生殖细胞中，主要定位于细胞核的常染色体区。SIRT2 具有催化核心结构部分，这也是Sirtuins家族高度保守的原因之一。SIRT3主要分布在细胞核中，它以257个氨基酸分子（44 kDa）的长链形式存在，N端含有一个线粒体靶序列。SIRT4 催化口袋中有一个保守的Ⅱ类区域，它被预测为α区螺旋区，对酶活性具有潜在的重要意义[7]。SIRT5 基因位于6p23，可编码310，299 个氨基酸的两种蛋白亚型。锌离子结构域和Rossmann 折叠域由14 个α 环和9 条β 链组成，形成底物和NAD+结合位点[8]。全面了解Sirtuins在睾丸组织中的定位、表达、功能及相关的信号通路，将有助于解决精子发生异常及有效改善精子质量。

2 Sirtuins在精子发生过程表达规律及功能

研究者通过使用不同的方法分析Sirtuins基因在精子发生过程中的表达规律。E.L.Bell 等[9]采用免疫印迹法发现SIRT1在睾丸中呈现高表达；免疫组织化学染色结果显示，在未分化的A 型精原细胞中未检测到SIRT1的表达，B型精原细胞及细线前期细胞中可检测到低水平表达的SIRT1，粗线期、二倍体和减数分裂期生精细胞SIRT1表达量最高。B.Ramatchandirin等[10]首次报道SIRT4在睾丸间质细胞中表达。P.W.Pan 等[11]报道，采用Western Blot 技术和免疫组化技术检测，SIRT6在睾丸中有表达，并发现SIRT6定位于晚期圆形精子到早期伸长精子的细胞核和成熟精子的顶体中，从而暗示了SIRT6在精子顶体反应中的作用。

最新研究表明，Sirtuins 家族蛋白在男性生殖健康中起着至关重要的作用：（1）Sirtuins在睾丸组织中高表达；（2）Sirtuins 的活性与细胞能量状态、NAD+浓度和NAD+与NADH 水平之间的波动密切相关；（3）NADH 水平主要取决于丙酮酸是转化为乳酸还是丙氨酸的过程。这三个特性决定了Sirtuins在调控睾丸精子发生过程起到了重要作用[12]。SIRT1缺失可导致垂体-下丘脑-睾丸轴功能紊乱，使促性腺激素、促卵泡激素和黄体生成素的水平降低、睾酮的合成受阻；雄性小鼠敲除SIRT1后，睾丸重量减轻、精子数量减少、异常精子比例增加、生育力降低[13]。高糖环境可使睾丸中PGC-1α/SIRT3轴发生紊乱，睾丸SIRT3水平降低可导致睾丸线粒体功能受损，睾丸氧化应激增加，精子畸形率增加[14]。

以上这些研究表明，Sirtuins在睾丸组织、生精细胞及成熟精子的顶体中均有高表达，参与性激素水平的调控，可能通过降低线粒体损伤、氧化应激等途径调控精子的发生及成熟。

3 Sirtuins参与精子发生的可能的调控机制

3.1 Sirtuins对细胞增殖和凋亡的影响

Sirtuins通过NAD+依赖的去乙酰化反应，其活性变化对细胞增殖、凋亡和细胞代谢具有重要调控作用、亦可调控细胞的DNA 修复、氧化应激、衰老等过程[15]。C.Tatone 等[16]研究发现，敲除SIRT1后可使精子在第二次减数分裂前期发生阻滞，精子细胞发生退化或死亡，显著减少小鼠精子数量，这与睾丸中细胞形态异常、细胞凋亡、DNA损伤密切相关；同时促凋亡基因p53活性的上调可激活细胞的乙酰化作用，抑制SIRT1的表达，从而导致雄性生殖细胞死亡。SIRT3可影响线粒体的功能，如ATP 的产生、活性氧的调节、细胞死亡和生酮作用[17]。SIRT3过表达可增强细胞ATP生成、葡萄糖摄取、糖原形成、乳酸生成，促进胃癌细胞增殖[18]，在SIRT3敲除后p21和Bax的表达显著升高，Bcl-2的表达降低，导致EC9706细胞的增殖抑制和细胞凋亡[19]。

综上所述，Sirtuins 在精子发生过程中通过调控凋亡相关基因的表达，来促进细胞增殖，维持睾丸生精细胞形态，减少雄性生殖细胞的死亡。

3.2 Sirtuins对细胞氧化损伤的影响

最近的研究表明，Sirtuins主要通过调节炎症，氧化应激和线粒体功能而参与衰老相关的各种疾病[20]。Sirtuins 参与调控细胞的氧化应激过程，SIRT1、SIRT3 和SIRT5 可保护细胞不受活性氧（ROS）的影响，SIRT2、SIRT6 和SIRT7 可调控氧化应激的关键基因[21]。SIRT1 激活剂可改善细胞线粒体DNA 含量，提高ATP 水平、降低ROS 形成；SIRT2 可通过调控G6PD K403 乙酰化水平来维持还原型辅酶Ⅱ（NADPH）稳态，降低细胞内ROS 水平，从而保护细胞免受氧化损伤[22]。研究表明，AMPK可通过激活SIRT3抑制心肌肥大，改善氧化损伤引发的心脏功能障碍[23]。SIRT4 既可诱导产生活性氧，又具备抗氧化作用，SIRT4 抑制超氧化物歧化酶2（SOD2）与SIRT3的结合，导致乙酰化增加，从而降低了SOD2活性，SIRT4参与并影响脂肪酸的代谢，ROS的生成增加，显著影响心脏功能[24]。SIRT5敲除后，可导致细胞ROS 水平升高，降低NADPH 水平，清除ROS 能力下降，增加细胞对氧化应激的敏感性[25]。敲除SIRT6的人间充质干细胞中的ROS水平升高，氧化还原代谢紊乱，氧化应激敏感性增强[26]。

综上所述，Sirtuins 在细胞的氧化应激过程中具有重要调节作用，可以降低细胞内ROS的形成，保护细胞免受氧化应激的损伤，在精子的发生及成熟过程中Sirtuins对氧化应激的调控作用还需进一步研究。

3.3 Sirtuins对信号通路的影响

SIRT1 被认为是PI3K/AKT 通路的负调控因子，它通过去乙酰化肿瘤抑制因子PTEN 及下调AKT和磷酸化水平来抑制胶质母细胞瘤细胞中的PI3K/AKT 通路，白藜芦醇上调SIRT1水平可以降低PI3K 和AKT 的磷酸化，当HepG2 细胞中SIRT1受到抑制时，PI3K 和AKT 的磷酸化显著升高[27]。RAO Y.等[28]研究证实，白藜芦醇可激活SIRT1，SIRT1 进一步激活LKB1/AMPK 通路，即SIRT1 对LKB1/AMPK 通路有正向调控作用。另有研究证明，白藜芦醇也可增加小鼠脂肪组织和肝脏中NAD+/NADH 比值，提高SIRT1 活性，使LKB1 乙酰化，激活AMPK通路[29-30]。

研究显示，HL60/A 细胞中shRNA 对SIRT2 的消耗导致多药耐药相关蛋白1(mrp1）水平降低，药物积累增强，并引发更多的凋亡。SIRT2表达下降可显著下调ERK1/2的磷酸化，而过表达则可引起ERK1/2 磷酸化上调。化学抑制剂PD98059 可以阻断ERK1/2 的信号通路，进一步诱导SIRT2 耗竭从而引起HL60/A 细胞凋亡，SIRT2的表达水平与DNR/Ara-C 耐药和ERK1/2 信号通路活性呈正相关[31]。He F.F.等[32]用免疫组化染色和Western blot检测SIRT2在肾小管间质纤维化（TIF）患者和单侧尿道梗阻小鼠中的表达情况，发现SIRT2参与成纤维细胞和TIF 的活化，SIRT2 通过抑制MDM2 信号通路抑制成纤维细胞活化。SIRT3 对自噬的调控是通过激活LKB1-AMPK-mTOR 信号通路实现的[33]。此外也有研究表明，SIRT3 可通过激活SOD2 以减轻ROS 的积累和抑制PI3K/AKT 信号，从而增加TGF-β 和核转录因子的易位（Smad）蛋白质[34]。

综上所述，Sirtuins 在不同类型细胞中通过激活不同的信号通路而发挥作用，Sirtuins 在精子发生过程中的信号通路还需要进一步深入研究。

3.4 Sirtuins对细胞能量代谢的调控

睾丸细胞之间的能量代谢及协同作用是保证正常精子发生的先决条件，睾丸中支持细胞利用葡萄糖通过糖酵解途径生成丙酮酸，并在乳酸脱氢酶（LDH）的作用下产生乳酸，而乳酸是睾丸中生殖细胞的主要能量来源[35]。研究表明，Sirtuins家族蛋白在调控糖酵解通路具有重要作用，小鼠睾丸支持细胞中AMPK基因特异性缺失可导致能量代谢紊乱，细胞内部乳酸和脂滴集聚，ATP生成减少，同时SIRT1表达降低，小鼠生育力下降[36]。SIRT1缺失下调GLUT1、GAPDH、PKM2、HK2的表达；SIRT1可导致糖酵解的负调控因子p53去乙酰化并失活，保护HIF-1α 不发生乙酰化和降解，增加GLUT1的表达[37-38]。

综上所述，精子发生依赖于睾丸细胞之间的能量代谢，Sirtuins家族蛋白参与调控糖酵解通路，因此，Sirtuins 对精子的发生及成熟具有重要的调控作用。

4 展望

精子的发生高度依赖于糖酵解代谢产生的能量，在此过程中主要受到代谢传感器Sirtuins调控，目前Sirtuins 家族在各研究领域已成为研究热点，已有研究结果显示SIRT1、SIRT6在睾丸中呈现高表达，SIRT4在睾丸间质细胞中表达，SIRT1的缺乏导致小鼠生精功能障碍、生精细胞数量减少、成熟精子减少、增加了附睾精子的DNA 损伤。但目前Sirtuins 对精子发生的调控机制尚不明确，还需进一步深入研究Sirtuins家族在精子发生过程中的作用机制、调控机制，这对进一步阐明精子发生及相关疾病的诊治都有重要的指导意义。