IL-17在宫颈癌Caski细胞生长及凋亡中的作用

薛纪森　　罗惜绍　　潘一帆　　马京杭　　吴文烈　胡燕

[摘要] 目的 通過检测不同浓度IL-17处理后宫颈癌Caski细胞与人外周血单核细胞（PBMC）共培养系统下癌细胞生长率及凋亡率情况，探讨IL-17所介导的免疫反应在高危型HPV相关宫颈癌发展中的作用。 方法 选取2017年9月至2019年6月期间我院就诊的健康女性及部分本院女性志愿者，抽取外周抗凝血10 mL用于提取人外周血单核细胞（PBMC），与包含高危型HPV序列的宫颈癌Caski细胞株进行共培养，经过不同浓度的rhIL-17处理，采用CCK-8法检测各组癌细胞的生长率，采用流式细胞术检测各组癌细胞的凋亡率。 结果 ①CCK-8法结果显示，低浓度组癌细胞生长率最高，为（125.65±7.28）%，高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;高浓度组癌细胞生长率为（110.56±9.39）%，同样高于对照组，低于低浓度组，但差异无统计学意义（P>0.05）;②流式细胞术结果显示，低浓度组宫颈癌细胞的凋亡率最低，为（10.67±0.20）%，低于对照组的（12.43±0.81）%，差异有统计学意义（P<0.05）;高浓度组癌细胞的凋亡率为（11.99±0.11）%，同样低于对照组，高于低浓度组，但差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 IL-17 所介导的免疫反应与宫颈癌的发展密切相关，其在肿瘤发展的不同阶段表现出双重效应，为进一步研究高危型HPV相关宫颈癌的免疫治疗措施提供了基本理论依据。

[关键词] 白细胞介素17;宫颈癌;人乳头瘤病毒;凋亡

[中图分类号] R737.33          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）09-0039-05

Role of IL-17 in the growth and apoptosis of Caski cells in cervical cancer

XUE Jisen1   LUO Xishao1   PAN Yifan2   MA Jinghang1   WU Wenlie1   HU Yan1

1.Department of Gynecology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou   325000， China; 2.Department of Anesthesiology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou   325000， China

[Abstract] Objective To detect the growth rate and apoptosis rate of cancer cells in the co-culture system of Caski cells in cervical cancer and human peripheral blood mononuclear cells （PBMC） treated with different concentrations of IL-17， so as to investigate the function of IL-17 mediated immune reaction in the development of high-risk HPV-related cervical cancer. Methods Healthy women and some female volunteers admitted to our hospital from September 2017 to June 2019 were selected，and 10 mL of peripheral anticoagulant was used to extract human PBMC， which were co-cultured with Caski cell in cervical cancer containing high-risk HPV sequence. After treatment with different concentrations of rhIL-17， the growth rate of each group of cancer cells was detected by CCK-8 method， and the apoptosis rate of each group of cancer cells was detected by flow cytometry. Results （1）CCK-8 method showed that the growth rate of cancer cells in the low concentration group was the highest（125.65±7.28）%，which was higher than that in the control group，with statistically significant difference（P<0.05）; The growth rate of cancer cells in the high concentration group was（110.56±9.39）%， which was also higher than that in the control group，the growth rate of cancer cells in the high concentration group was lower than that in the low concentration group，but without statistically significant difference（P>0.05）. （2）The results of flow cytometry showed that the apoptosis rate of cervical cancer cells in the low concentration group was the lowest（10.67±0.20）%， which was lower than that of（12.43±0.81）% in the control group，with statistically significant difference（P<0.05）; The apoptosis rate of cancer cells in the high concentration group was（11.99±0.11）%，also lower than that in the control group，the apoptosis rate of cervical cancer cells in the high concentration group was higher than that in the low concentration group，but without statistically significant difference（P>0.05）. Conclusion The immune reaction mediated by IL-17 is closely related to the development of cervical cancer，and it shows double effects in different stages of tumor development，which provides a basic theoretical basis for further research of immunotherapy measures for high-risk HPV-related cervical cancer.

[Key words] Interleukin 17; Cervical cancer; Human papillomavirus; Apoptosis

宫颈癌是威胁女性生命健康的常见恶性肿瘤，其发病率及死亡率逐年上升，2018 年世界卫生组织最新数据显示[1]，全球每年新发宫颈癌病例569 800例和死亡病例311 400例，而2015年中国数据显示，妇女每年新发宫颈癌病例为98 900例，是第二高发国家[2]。宫颈癌的病因已明确为高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染，但临床上HPV感染多数呈一过性，只有10%左右的高危型HPV呈慢性持续感染状态，进而引发宫颈癌[3]。近年来研究[4-5]发现，白细胞介素17（Interleukin-17，IL-17）作为辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）分泌的特异性效应因子，具有强大的招募、激活中性粒细胞的功能，是人體针对外来病原体感染产生免疫应答过程中的重要细胞因子，在多种疾病的发生和发展中均发挥了重要的作用。前期研究提示IL-17所介导的免疫反应与宫颈癌的发展进程密切相关[6-7]。故本研究针对IL-17在宫颈癌Caski细胞生长、凋亡中的具体作用，以探讨IL-17介导的免疫应答与高危型HPV感染相关宫颈癌发生、发展之间的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年9月至2019年6月我院就诊的健康女性及部分本院女性志愿者共5位，分别抽取外周抗凝血10 mL用于提取PBMC。纳入标准：①育龄期健康女性;②非月经期;③曾有性生活;④经宫颈液基细胞学及HPV检测无异常者。排除标准：①妊娠、生殖系统或全身其他系统各种急、慢性疾病，包括感染性疾病、免疫性疾病、结缔组织病或恶性肿瘤等者;②近期接受过各种药物治疗者;③术前四项任何一项阳性者。本研究经温州医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准，标本采集前获得患者知情同意，期间采集所有血液样本均用于本研究。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器  细胞培养主要试剂包括Caski细胞（上海盖宁生物科技有限公司），人外周血淋巴分离液（北京索莱宝科技有限公司），人重组白介素17（Recombinant Human IL-17，rhIL-17，novoprotein）、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS，BBI Life Sciences）、磷酸缓冲盐溶液（Phosphate buffer saline，PBS）、DMEM（Dulbecco′s modified eagle medium）、MEM（Modified eagle medium）及R1640完全培养基（江苏凯基生物技术股份有限公司）;CCK-8法细胞增殖检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），全自动酶标（北京六一生物科技有限公司）;流式细胞术主要抗体Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（杭州联科生物技术有限公司），NovoCyte流式细胞仪（型号NovoCyte 2060R，杭州艾森生物有限公司）。

1.2.2 细胞培养  人宫颈癌细胞Caski，加入新鲜配制的培养基DMEM+10%FBS+1%双抗，置于37℃，5%CO2培养箱中培养至状态良好，经胰酶消化后重悬Caski细胞与PBMC进行共培养至48 h，以便进行后续实验。

1.2.3 人外周血单核细胞分离  每次采集健康女性外周抗凝全血10 mL后立即送达实验室，加入新鲜培养基R1640+10%FBS+1%双抗，用等体积的PBS稀释，在离心管中加入适量的分离液，800 g离心30 min后出现分层，小心吸取中间的白膜层至离心管中，加入10 mL的PBS洗涤，250 g离心10 min，弃上清，再次加入5 mL的PBS洗涤，250 g离心10 min后弃上清，加入培养基重悬至瓶中，将细胞置于培养箱中与Caski细胞进行1∶1共培养。

1.2.4 主要试剂配制  rhIL-17用10 mL PBS溶解1 μg粉末得100 000 pg/mL的母液，作用细胞时2000倍稀释加入得终浓度50 pg/mL。后续Caski细胞和PBMC以1∶1的比例共培养系统中加入相应浓度的rhIL-17处理，共分为两组：高浓度组为50 pg/mL，低浓度组为5 pg/mL。以Caski细胞加PBMC共培养组为对照组。

1.2.5 CCK-8法检测各组癌细胞的生长率  将待测的96孔板细胞换成相同的培养基，每孔100 μL;每孔加入10 μL CCK8试剂，置于培养箱中孵育2 h;酶标仪在450 nm波长处检测每孔的吸光值，将对照组Caski细胞的存活率定义为100%，根据各组吸光值计算各组Caski细胞的生长率。

1.2.6 流式细胞术检测各组癌细胞的凋亡率  收集（1～3）×106个细胞，加1 mL PBS，1500 rpm离心，3 min，洗两遍;取300 μL预冷的1×Binding Buffer 重悬细胞;每管各加入3 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI-PE;轻微混匀后，室温避光孵育10 min;再向每管中加入200 μL预冷的1×Binding Buffer，混匀后上流式仪检测。

1.3 观察指标及评价标准

①CCK-8法检测各组Caski细胞的吸光度值，与对照组进行对比，评价经高浓度和低浓度组rhIL-17处理后癌细胞的生长情况;②流式细胞术检测经Annexin V-FITC和PI-PE染色后各组Caski细胞计数，计算得出Caski细胞的凋亡百分率，与对照组进行对比，评价经高浓度和低浓度组rhIL-17处理后癌细胞的凋亡情况。

1.4 统计学方法

采用Graphpad prism7统计学软件分析实验数据及制图。符合正态分布的计量资料以（x±s）表示;正态性和方差齐性检验后行方差分析，各组间两两比较采用Bonferroni法检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rhIL-17不同浓度组和对照组Caski细胞的生长率比较

将对照组Caski细胞的生长率定义为100.00%，低浓度组Caski细胞生长率为（125.65±7.28）%，高浓度组Caski细胞生长率为（110.56±9.39）%。低浓度组Caski细胞生长率最高，明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;高浓度组Caski细胞生长率同样高于对照组，低于低浓度组，但差异无统计学意义（P>0.05），提示低浓度组Caski细胞生长最快，对照组Caski细胞生长最慢。

2.2 流式细胞术检测各组Caski细胞凋亡率

2.2.1 流式细胞术检测的设阈方法及各组细胞染色结果   经Annexin V-FITC和PI-PE染色后，分别检测rhIL-17不同浓度组与对照组Caski细胞的凋亡率。

2.2.2 rhIL-17不同浓度组和对照组Caski细胞的凋亡率比较  低浓度组Caski细胞的凋亡率最低，为（10.67±0.20）%，低于对照组的（12.43±0.81）%，差异有统计学意义（P<0.05）;高浓度组Caski细胞的凋亡率为（11.99±0.11）%，同样低于对照组，高于低浓度组，但差异无统计学意义（P>0.05），提示低浓度组Caski细胞凋亡最少，对照组Caski细胞凋亡最多。

3 讨论

白介素17（Interleukin-17，IL-17）是在20世纪90年代发现的一类多效性细胞因子，可由多种免疫细胞群分泌产生，其中最主要的是辅助性T细胞 17（T helper cell 17，Th17）亚群，其参与人体多种生理和病理生理状态，包括癌症、自身免疫性疾病以及感染性疾病的免疫反应[8-10]。隨着近年来研究的进一步深入，IL-17在许多疾病中的作用已受到广泛关注。大量的实验结果显示，IL-17在各种疾病的发生和发展中均发挥了重要作用[11-16]。已往多数研究认为，IL-17具有致病作用而不是保护性作用，最早支持IL-17的促肿瘤作用的是Tartour等[17]的研究，用IL-17培养的宫颈癌细胞在体外未对癌细胞增殖产生直接影响，但通过转染IL-17 cDNA的两株细胞系后的裸鼠移植瘤体积相比对照组明显增大。Alves等[18]也认为，Th17及IL-17抑制宿主免疫反应，而不是诱导有效的保护性免疫反应，从而导致HPV的复制和持续感染，促进宫颈肿瘤的生长和进展。然而部分新的研究表明[19-20]，IL-17同时具有促进肿瘤和保护肿瘤的双重功能，在早期肿瘤发生过程中，IL-17支持肿瘤生长，而在已形成的肿瘤中，IL-17的产生可增强抗肿瘤免疫。

为明确IL-17 介导的免疫反应与高危型HPV病毒相关宫颈癌发展之间的关系，本研究采用CCK-8法检测宫颈癌Caski细胞与人外周血单核细胞（PBMC）共培养时的生长情况，经不同浓度rhIL-17的处理后，结果显示，低浓度组的癌细胞生长最快，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），高浓度组的癌细胞相比对照组生长快，但较低浓度组生长慢，差异无统计学意义（P>0.05）。提示宫颈癌细胞在低浓度IL-17水平时生长最快，而在浓度升高后癌细胞生长变慢，可见在肿瘤早期IL-17浓度较低时表现出促肿瘤作用，而随着肿瘤的发展，IL-17浓度升高，可能其促肿瘤效应开始下降。

本研究同时采用流式细胞术检测宫颈癌Caski细胞与人外周血单核细胞（PBMC）共培养后各组癌细胞的凋亡情况，经不同浓度rhIL-17的处理后，结果显示，低浓度组癌细胞的凋亡率最低，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），高浓度组的癌细胞相比对照组凋亡率也低，但较低浓度组凋亡率高，差异无统计学意义（P>0.05）。提示在低浓度IL-17水平时宫颈癌细胞凋亡减少，表现出促肿瘤效应，而在浓度升高后癌细胞凋亡开始增加，其促肿瘤效应开始下降，与CCK-8法结果一致。

IL-17 所介导的免疫反应与宫颈癌的发展密切相关，其在肿瘤发展的不同阶段表现出双重效应，在肿瘤早期表现出促肿瘤作用，而在进展期则表现为增强抗肿瘤免疫。因此，IL-17作为目前癌症研究中很有前景的免疫治疗靶点，本研究结果对IL-17相关免疫治疗提出挑战，实行一刀切的治疗方案可能并不理想，为进一步研究高危型HPV相关宫颈癌的免疫治疗措施提供了基本理论依据。

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（收稿日期：2020-11-12）