曲霉属真菌Aspergillus clavatonanicus HNMF114的次生代谢产物及其抗菌活性研究

王府润，张圣良，孔凡栋，马青云，谢晴宜，戴好富，陈 萍*，赵友兴*

1海南大学园艺学院，海口570228；2中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口市热带天然产物研究与利用重点实验室；3中国热带农业科学院海南热带农业资源研究院，海口571101

在众多真菌中，曲霉属真菌作为海洋真菌中的优势菌株之一，有丰富的酶类，能够产生多种类型的、具有生理活性的次级代谢产物[1]。曲霉属真菌是一种丝状真菌，在自然界广泛存在，代谢产物结构类型多样，且具有多种生物活性[1]。海洋灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)所产生的次级代谢产物灰绿霉素A是聚酮类的产物之一，目前聚酮类药物在市场所占畅销药的比例高达20%[2]。在我们从海洋真菌中寻找活性代谢产物的过程中，对一株海口湾中华紫蛤共附生真菌AspergillusclavatonanicusHNMF114的活性代谢产物进行研究，从中发现一些喹唑啉酮生物碱类化合物，部分化合物具有细菌群体感应抑制活性[3]。本文继续对真菌A.clavatonanicusHNMF114的非喹唑啉酮生物碱类次生代谢产物进行了研究，测定了次生代谢产物的抗菌活性，以期丰富海洋真菌生物活性物质类型。

1 材料与方法

1.1 菌株

海洋真菌Aspergillussp.HNMF114分离自海南文昌海域的中华紫蛤，菌落正面浅肉桂褐色，反面黄褐色。分生孢子头初为棒形，少量生自气生菌丝。GenBank登录号为MK732953。现保藏于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

1.2 仪器和试剂

旋转蒸发仪(EYELA公司，日本)；核磁共振光谱仪(AVANCE-500，德国Bruker公司)；质谱仪(Mi-cromassAutospec-Uitima TOF)；单人单面净化工作台(SW-CJ-1FD型苏州净化有限公司)；高效液相色谱仪(安捷伦1260分析型，美国安捷伦科技有限公司)；半制备高效液相色谱仪(SUM-MITP680A，戴安，美国)；酶标仪(ELX-800，Bio Tex公司)；鼓风干燥箱(上海智城分析仪器公司)；万分之一电子天平(美国丹佛仪器公司)；pH计(瑞士梅特勒-托利多)；循环水真空泵(SHZ-D，郑州予华仪器制造公司)；摇床(上海福玛实验设备公司)；柱色谱硅胶和薄层色谱硅胶板(青岛海洋化工厂产品)；氘代试剂购自Merck公司；色谱乙腈购自天津康科德公司；其他试剂均为重蒸工业试剂。

1.3 培养基

1.3.1 PDA培养基

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.5。

1.3.2 真菌二号

葡萄糖10 g，麦芽糖20 g，味精10 g，酵母膏3 g，玉米浆1 g，甘露醇20 g，MgSO40.3 g，KH2PO40.5 g，水1 L，pH 6.5。

1.3.3 酸水

0.1%三氟乙酸。

1.4 菌株发酵

将菌株在PDA培养皿培养三天，接种于装有150 mL PDB培养基的500 mL三角瓶中，180 rpm，25 ℃摇3天，制成种子液。配制真菌二号培养基60 L，每瓶分装300 mL于1 000 mL的三角瓶中。灭菌后将种子液接种于真菌二号培养基，每瓶1 mL，室温静置发酵30天。

1.5 提取与分离

发酵结束后，过滤，分离菌丝和发酵液，使用与发酵液同体积的乙酸乙酯分别萃取发酵液和破碎处理过的菌丝三次。合并萃取液并旋蒸，最终得到浸膏47.13 g。浸膏使用减压硅胶柱(石油醚:乙酸乙酯)进行分离，以8∶1→1∶2的梯度洗脱，分段收集。得到15个组分(Fr.1～Fr.15)。其中Fr.3(0.49 g)经过反相硅胶柱色谱(甲醇/水，20%→100%)梯度洗脱后，得到了化合物9(15 mg)和1(7.8 mg)。Fr.11(2.37 g)经过反相硅胶柱色谱(甲醇/水系统，20%→100%)，结合半制备HPLC(C18半制备柱，25%甲醇/酸水系统)得到化合物3(4.1 mg，4 mL/min，tR=18.0 min)。Fr.4(1.01 g)经过反相硅胶柱色谱(甲醇/水系统，30%→100%)梯度洗脱得到5个组分(Fr.4.1～Fr.4.5)，其中Fr.4.3经过反相硅胶柱色谱(乙腈/水系统，20%→60%)得到化合物8(0.9 mg)。Fr.6(7.37 g)经过反相硅胶柱色谱(甲醇/水系统，20%→70%)梯度洗脱后得到化合物4(45.7 mg)。Fr.14(1.33 g)经过反相硅胶柱色谱(甲醇/水系统，10%→90%)梯度洗脱得到7个组分(Fr.14.1～Fr.14.7)，Fr.14.5通过半制备HPLC(C18半制备柱，50%甲醇/水系统)得到化合物6(1.5 mg，4 mL/min，tR=5.0 min)、7(2.1 mg，4 mL/min，tR=6.4 min)和5(5.5 mg，4 mL/min，tR=8.5 min)，Fr.14.6经过反相硅胶柱色谱(甲醇/水系统，20%→50%)，结合半制备HPLC(C18半制备柱，25%乙腈/酸水系统)得到化合物2(3.5 mg，4 mL/min，tR=10.7 min)。

1.6 抑菌活性测试

采用96孔板微量法[4,5]，测定化合物对常见四种致病菌的抑制活性。这四种菌分别是金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，李斯特菌，大肠杆菌。将待测样品溶液配制成100 μg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱备用。无菌96孔板的第1列加入197.44 μL灭菌的LB液态培养基(0.3%牛肉膏，0.2%酵母浸粉，1%蛋白胨，0.5% NaCl，pH 7.5)，第2～12列加入100 μL灭菌的LB液态培养基。第1列加入2.56 μL待测化合物，混匀后，二次稀释法[6]稀释至11列，第11列不加菌作为阴性对照，第12列不加药作为空白对照。取100 μL病原菌(1×108～2×108CFU/mL)加入至100 mL LB培养基中，混匀得病原菌菌液。取100 μL加入上述制备好的无菌96孔板的第1～10列及第12列。此时，第1～10孔内浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。置37 ℃恒温培养箱培养18～22 h观察结果，如该孔中呈浑浊状态，说明相应浓度的化合物无抗病菌活性。若孔内澄清，说明小孔内细菌被完全抑制生长，该浓度为化合物对该种病菌的最低药物浓度(MIC)。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

图1 化合物1的HMBC和COSY相关信号Fig.1 Key HMBC and COSY correlations of compound 1

表1 化合物1的1H NMR(500 MHz)和13C NMR(125 MHz)数据(CD3OD)

化合物2黄色油状物；分子式为C22H20N4O2；ESI-MS：m/z395 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.17(1H，d，J= 7.9 Hz，H-7/7′)，7.11(1H，d，J= 7.8 Hz，H-4/4′)，6.87(1H，t，J= 7.5 Hz，H-5/5′)，6.78(1H，t，J= 7.5 Hz，H-6/6′)，6.40(1H，s，H-2/2′)，3.69(1H，s，H-11/11′)，2.51(1H，dd，J= 14.2，3.4 Hz，H-10a/10′a)，1.97(1H，dd，J= 14.2，5.8 Hz，H-10b/10′b)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：124.5(d，C-2/2′)，111.4(s，C-3/3′)，108.8(d，C-4/4′)，121.0(d，C-5/5′)，118.7(d，C-6/6′)，118.5(d，C-7/7′)，136.1(s，C-8/8′)，127.4(s，C-9/9′)，30.1(t，C-10/10′)，55.4(d，C-11/11′)，166.9(s，C-12/12′)。以上数据与文献[8]报道基本一致,故确定该化合物为Cyclo(L-Trp-L-Trp)。

化合物3黄色油状物；分子式为C8H6N2O2；ESI-MS：m/z161 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.83(1H，d，J= 7.5 Hz，H-5)，7.58(1H，t，J= 7.2 Hz，H-7)，7.12(1H，m，H-6)，7.12(1H，m，H-8)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：150.3(s，C-2)，162.9(s，C-4)，127.0(d，C-5)，122.4(d，C-6)，135.0(d，C-7)，115.4(d，C-8)，114.3(s，C-4a)，140.8(s，C-8a)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故确定该化合物为2,4(1H,3H)-quinazolinedione。

化合物4白色粉末状物；分子式为C10H12O3；ESI-MS：m/z179 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.26(1H，s，H-6′)，2.28(3H，s，H-1)，1.95(3H，s，H-8′)，1.85(3H，s，H-7′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：26.1(q，C-1)，203.7(s，C-2)，113.4(s，C-1′)，162.0(s，C-2′)，111.2(s，C-3′)，161.1(s，C-4′)，116.3(s，C-5′)，130.8(d，C-6′)，7.9(q，C-7′)，16.2(q，C-8′)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故确定该化合物为clavatol。

化合物5黄色油状物；分子式为C24H22O8；ESI-MS：m/z473 [M+Cl]-；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.94(1H，s，H-6/6′)，5.56(1H，s，H-3/3′)，3.89(3H，s，H-11/11′)，3.68(3H，s，H-13/13′)，2.64 (3H，s，H-12/12′)；13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：161.5(s，C-2/2′)，87.5(d，C-3/3′)，169.5(s，C-4/4′)，138.4(s，C-5/5′)，111.7(d，C-6/6′)，59.3(s，C-7/7′)，107.7(s，C-8/8′)，152.9(s，C-9/9′)，106.8(s，C-10/10′)，56.8(q，C-11/11′)，23.6(q，C-12/12′)，56.2(q，C-13/13′)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故确定该化合物为kotanin。

化合物6淡黄色油状物；分子式为C22H18O8；ESI-MS：m/z409 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.41(1H，s，H-6/6′)，5.33(1H，s，H-3/3′)，3.82(3H，s，H-11/11′)，2.45(3H，s，H-12/12′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：170.0(s，C-2/2′)，85.1(d，C-3/3′)，154.3(s，C-4/4′)，135.8(s，C-5/5′)，118.3(d，C-6/6′)，156.4(s，C-7/7′)，109.1(s，C-8/8′)，162.1(s，C-9/9′)，107.1(s，C-10/10′)，56.3(q，C-11/11′)，23.3(q，C-12/12′)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故确定该化合物为orlandin。

化合物7淡黄色油状物；分子式为C23H20O8；ESI-MS：m/z423 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.88(1H，s，H-6)，6.49(1H，s，H-6′)，5.52(1H，s，H-3)，5.34(1H，s，H-3′)，3.86(3H，s，H-11)，3.82(3H，s，H-11′)，3.64(3H，s，H-13)，2.61(3H，s，H-12)，2.45(3H，s，H-12′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：162.1(s，C-2)，87.4(d，C-3)，170.1(s，C-4)，137.7(s，C-5)，111.6(d，C-6)，159.5(s，C-7)，107.0(s，C-8)，153.2(s，C-9)，109.8(s，C-10)，56.8(q，C-11)，23.6(q，C-12)，21.4(q，C-13)，161.8(s，C-2′)，87.4(d，C-3′)，169.6(s，C-4′)，136.9(s，C-5′)，111.2(d，C-6′)，159.5(s，C-7′)，105.4 (s，C-8′)，154.1(s，C-9′)，107.6(s，C-10′)，56.1(q，C-11′)，23.4(q，C-12′)。以上数据与文献[13]报道基本一致，鉴定化合物为desmethylkotanin。

化合物8无色油状物；分子式为C12H14N2O2；ESI-MS：m/z217 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.31(1H，d，J= 7.7 Hz，H-2)，7.68(1H，d，J= 7.7 Hz，H-7)，7.76(1H，t，J= 7.7 Hz，H-8)，7.51(1H，t，J= 7.7 Hz，H-1)，4.57(1H，d，J= 3.7 Hz，H-9)，2.32(1H，m，H-10)，1.15(3H，d，J= 6.9 Hz，H-12)，0.92(3H，d，J= 6.8 Hz，H-11)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：135.0(d，C-1)，127.3(d，C-2)，126.9(s，C-3)，156.9(s，C-4)，148.5(s，C-5)，141.1(s，C-6)，126.8(d，C-7)，136.7(d，C-8)，75.5(d，C-9)，33.8(d，C-10)，19.3(q，C-11)，15.7(q，C-12)。以上数据与文献[14]报道基本一致，故确定该化合物为(S)-2-(1-hydroxy-2,2-dimethylpropyl)quinazolin-4(3H)-one。

化合物9黄棕色油状物；分子式为C14H16N2O3；ESI-MS：m/z259 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.20(1H，d，J= 7.9 Hz，H-2)，7.82(1H，t，J= 7.9 Hz，H-8)，7.68(1H，d，J= 7.9 Hz，H-7)，7.53(1H，t，J= 7.9 Hz，H-1)，5.14(1H，d，J= 7.9 Hz，H-9)，2.30(1H，m，H-10)，2.16(3H，s，H-14)，1.06(3H，d，J= 6.6 Hz，H-12)，0.98(3H，d，J= 6.8 Hz，H-11)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：128.2(d，C-1)，127.2(d，C-2)，119.4(s，C-3)，160.5(s，C-4)，154.2(s，C-5)，146.0(s，C-6)，128.0(d，C-7)，136.0(d，C-8)，79.6(d，C-9)，33.1(d，C-10)，18.8(q，C-11)，18.4(q，C-12)，172.2(s，C-13)，20.6(q，C-14)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故确定该化合物(S)-2-methyl-1-(4-oxo-3,4-dihydroquinazolin-2-yl) propyl acetate。

2.2 抑菌活性测试结果

对分离得到的部分化合物分别进行乙酰胆碱酯酶抑制活性和抑菌活性测试。乙酰胆碱酶没有明显活性。新化合物1对大肠杆菌的生长具有一定的抑制作用，最小抑菌浓度(MIC)为2 μg/mL。化合物4、9对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，最小抑制浓度分别为1 μg/mL和4 μg/mL。化合物5对枯草芽孢杆菌有一定的抑制作用，最小抑制浓度分别为8 μg/mL。化合物4、5、9对李斯特菌有一定的抑制作用，最小抑制浓度分别为4、4和8 μg/mL。见表2。

图2 化合物1～9的化学结构Fig.2 Chemical structures of compounds 1-9

表2 化合物1～9的MIC值

3 结论

本研究从真菌HNMF114发酵产物中分离得到了9个化合物，包括1个新化合物，按照结构类型可分为香豆素类、喹唑啉类和环二肽类等。抗菌活性测试显示新化合物1对大肠杆菌的生长具有较强的抑制作用，最小抑菌浓度(MIC)为2 μg/mL，化合物4、9对金黄色葡萄球菌有抑制作用。这些化合物没有显示乙酰胆碱酶抑制活性。有研究报道化合物5和6对尖孢镰刀菌有明显的抑制作用[16]。喹唑啉类化合物是一类重要的含氮稠杂环化合物，相关研究报道该化合物有抑制组织蛋白激酶C-θ[17]的活性以及镇痛、抗炎[18]的作用。从海洋放线菌中发现的新异戊烯二酮哌嗪[19]与化合物2结构类似，其中具有桥连结构的nocardioazine A被证明是一个膜蛋白外排泵P-糖蛋白的非细胞毒性抑制剂。曲霉属真菌被报道具有多种生物活性物质，本研究团队在番木瓜中发现了曲霉等属的一些真菌，并且部分真菌具有保鲜功效[20]。但因次生代谢产物非菌体生长必需物质，故而产量较低，且对其具体生物合成途径了解不够，后期可结合基因组学、生物合成等技术对曲霉属真菌次生代谢产物做深入挖掘，为合理开发利用热带生物附生真菌资源提供科学理论依据。

致谢：中国热带农业科学院热带生物技术研究所在分离鉴定工作中提供的部分设备和帮助。