姜黄素对大鼠运动性心肌纤维化的保护作用

牛衍龙，曹建民，王 祯，周海涛，张 静，胡 戈，程鑫云，蔡博文

1赣南医学院康复学院；2赣州市康复医学重点实验室，赣州 341000；3北京体育大学运动人体科学学院，北京 100084；4北京联合大学；5北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京 100101；6常州大学体育学院，常州 213164

心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是心肌损伤后出现的以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积、胶原成分比例失衡为特征的病理过程，与多种心脏疾病(心肌梗死、慢性心力衰竭、心房纤颤等)关系密切[1]。研究表明，过度的生理应激可引发心肌组织炎症反应并导致心肌纤维化及心肌损伤[2]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族成员p38 MAPK，在病理或生理应激下被激活后可通过磷酸化丝裂原和应激蛋白激酶1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1，MSK1)激活核转录因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)[3]。NF-κB是炎症反应的主要调控因子，由同源与异源NF-κB/Rel蛋白二聚体构成，活化后入核，诱导转化生长因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等促炎因子的表达，其中TGF-β1是机体肌肉组织纤维化主要诱导因子[4]。姜黄素是多年生植物姜黄中提取的生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌和神经保护等多种生理和药理活性[5]。课题组前期研究证实[6-8]，训练期间的姜黄素干预可以延缓和抑制过度运动应激诱发的氧化应激和运动性心肌损伤，同时可有效地抑制过度运动应激诱发炎症反应，下调TGF-β1等促炎因子含量，改善运动性肾脏纤维化，保护肾脏功能/结构。本研究采用6周递增负荷跑台训练建立长时程、大强度运动致运动性脏器损伤动物模型[9]，探究姜黄素通过调控p38 MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白质活化和表达，抑制心肌组织炎症因子的合成，缓解长时程、大强度运动所致心肌ECM过度沉积，进而改善心肌纤维化的机制。

1 材料与试剂

1.1 实验动物

44只49天龄雄性SD大鼠，体重200～220 g，购于北京大学医学部实验动物科学部，许可证编号：SCXK(京)2016-0010。标准实验动物环境下饲养(温度20～24 ℃，相对湿度50%～70%，昼夜交替各12 h)。基础饲料由中华人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物饮用蒸馏水(不限制进食量)。实验周期46天，递增负荷训练42天。

1.2 实验药物与试剂

姜黄素(纯度>99%，陕西源泰生物科技公司，批号：17012571)；羧甲基纤维素钠(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；大鼠TGF-β1、TNF-α、IL-1β和心肌肌钙蛋白I(cardiac troponinc I，cTNI)ELISA试剂盒(美国Abcam公司，试剂盒批号：ab119558，ab100785，ab100768，ab246529)；p38 MAPK、p-p38 MAPK和NF-κB p65抗体(德国Sigma-aldrich公司，抗体批号：SAB4500491、M8177、SAB4502615)。

1.3 仪器

动物跑台(杭州段式制造厂)；7020 全自动生化分析仪(HITACHI公司，日本)；Wellscan MK3 酶标仪(雷博公司，美国)；RM2016病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；E100正置光学显微镜(Nikon公司，日本)；Pannoramic MIDI全自动数字切片扫描系统(3D HISTECH公司，匈牙利)；Allegra 25R台式高速离心机(Beckman Coulter公司，美国)；NR-B17CC超低温冰箱(Panasonnic 公司，日本)；ISO9001电子天秤(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 动物训练与给药

44只7周龄SD大鼠适应性喂养4天后，随机分组：对照组(control group，C组，12只)，模型组(model group，M组，16只)和姜黄素+模型组(curcumin+model group，CM组，16只)。C组安静饲养，不进行任何运动干预；M组、CM组采用6周递增负荷跑台训练(参考相关文献[10]并结合前期研究[9])，具体方案如图1。姜黄素以0.5%羧甲基纤维素钠配制成悬浊液，CM组于每日训练前1 h进行灌胃(200 mg/kg，5 mL/kg)[6-9]，其余组于同一时间点以等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。

图1 大鼠跑台训练方案Fig.1 Treadmill modeling program of rat注：从第二周开始，每次训练初始速度为10 m/min，每5 min增加5 m/min，直到本周目标强度。最后一周训练，大鼠若无法维持目标强度，则运动至力竭。Note:Training started from 10 m/min and increased by 5 m/min every 5 min until the target speed of this week from 2nd week.During the last week of training,if the rats could not maintain the target speed,they would exercise to exhaustion.

2.2 取材与标本制作

受训练强度等因素影响，M组、CM组大鼠均出现意外死亡，分别剩余13只、15只。

末次训练结束24 h，2%浓度的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，3 000 rpm离心10 min分离血清后放入-20 ℃冰箱保存待测。快速分离心脏，置于预冷的生理盐水中洗清血污。切取1 mm×1 mm×1 mm心尖处心肌组织，放入2.5%戊二醛制备透射电镜样品；另切取部分右心室心肌组织放入4%多聚甲醛固定；剩余心脏组织锡纸包裹后投入液氮暂存，而后转移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 心肌组织病理学检测

取出戊二醛固定液中的心肌组织，1×PBS和蒸馏水分别洗3次，1%锇酸固定后蒸馏水洗3次，2%铀染1 h，蒸馏水洗后(铝箔中脱水)分别浸入梯度丙酮(30%、50%、70%、90%、无水丙酮)，渗透过程为树脂：丙酮1∶3混合液1 h，树脂：丙酮1∶1混合液2 h，树脂：丙酮2∶1混合液过夜，经过3次树脂渗透后过夜，次日60 ℃烘箱高温聚合，精修组织块，切片机制成1 μm切片并捞至铜网中，透射电镜观察心脏超微结构。

取出多聚甲醛固定液中的心肌组织，流水冲洗24 h，梯度乙醇(50%、70%、80%、90%、95%、无水乙醇)脱水，二甲苯透明后石蜡渗透，温度保持在62 ℃，包埋机包埋，横断面切片(厚度为4 μm)烘干，HE染色观察心脏组织病理学改变。

2.4 心肌组织纤维化程度检测

心肌组织石蜡切片脱蜡至水，PAS染色液染色，脱水，封片。显微镜镜检，每个心肌组织标本随机选取5个视野，采用ImageJ图像分析系统分析心肌糖原容积分数(心肌糖原容积分数=视野内糖原总面积/视野心肌组织总面积)，评定心肌纤维化程度。

2.5 心肌损伤及炎症因子测定

酶联免疫吸附法检测血清中心肌损伤因子cTNI和心肌组织中炎症因子TGF-β1、TNF-α和IL-1β含量。

2.6 心脏组织蛋白质表达量测定

免疫组织化学法检测心肌组织p38 MAPK、p-p38 MAPK和NF-κB p65蛋白质表达。取心脏组织石蜡切片进行脱蜡脱水、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、一抗与二抗孵育、DAB染色、复染细胞核、封片等操作，数字扫描仪进行断面全景扫描，计算组织化学评分[11]：细胞核阳性由强至弱依次为深棕、棕黄、浅黄，蓝色为阴性。H-score =(浅黄色细胞密度×1)+(棕黄色细胞密度×2) +(深棕色细胞密度×3)。

2.7 数据统计

3 结果

3.1 大鼠体重变化

由图2可知，实验正式开始前，各组大鼠体重组间无显著性差异(P>0.05)；6周训练结束后，M组、CM组均显著低于C组(P<0.01)，而组间无显著差异(P>0.05)。

图2 大鼠体重变化Fig.2 Weight changes of rats注：与C组比，##P<0.01。Note:Compared with group C,## P<0.01.

3.2 大鼠心肌组织形态学及超微结构变化

400倍光镜下观察大鼠右心室心肌组织形态。由图3可知，C组心肌纤维横纹清晰，排列整齐，肌细胞边界明确，细胞质呈红色，细胞核呈深蓝色且分布相对均匀，无明显炎症浸润。M组心肌纤维出现断裂，细胞核出现固缩现象，细胞边界模糊不清，并有炎症浸润、结缔组织增生。CM组无明显异常，与C组相似。

图3 大鼠心肌组织形态学变化(HE,×400)Fig.3 Pathological changes in myocardial tissue of rats(HE,×400)

6 000倍透射电镜下观察大鼠心肌纤维超微结构。由图4可知，C组肌丝束结构正常，A带、I带、H带和Z带分布正常，线粒体结构正常；M组肌纤维线粒体嵴短缩，并由部分出现空泡变性。CM组与C组相似。

图4 大鼠心肌组织超微结构(TEM,×6000)Fig.4 Ultrastructure of rat myocardial tissue(TEM,×6000)

3.3 大鼠心肌组织ECM沉积

400倍光镜下观察PAS染色后心肌组织，并计算心肌糖原容积分数。由图5、表1可知，大鼠心肌糖原容积分数，M、CM组显著高于C组(P<0.01，P<0.05)，CM组显著低于M组(P<0.05)。

图5 大鼠心肌组织ECM沉积情况(PAS ×400)Fig.5 ECM deposition in myocardial tissue of rats(PAS ×400)

表1 大鼠心肌组织糖原容积分数

3.4 大鼠心肌组织炎症因子的含量变化

由表2可知，血清中心肌损伤因子cTNI含量：M组显著高于C组(P<0.01)，CM组显著低于M组(P<0.01)；心肌组织TGF-β1含量：M、CM组显著高于C组(P<0.01)，CM组显著低于M组(P<0.01)；TNF-α：M、CM组显著高于C组(P<0.01，P<0.05)，CM组显著低于M组(P<0.01)；IL-1β：M、CM组显著高于C组(P<0.01)，CM组显著低于M组(P<0.05)。

表2 大鼠心肌损伤标志物及炎症因子含量

3.5 大鼠心肌组织相关信号通路蛋白质表达

选取400倍光镜视野并计算相关信号通路蛋白质的组织化学评分(H-Score)，由图6、表3可知：p38 MAPK，各组间无显著性差异(P>0.05)；p-p38 MAPK，M组显著高于C和CM组(P<0.01)；而p-p38 MAPK/p38 MAPK，M组较C和CM组有升高趋势，但组间无显著性差异(P>0.05)；NF-κB p65，M组显著高于C组(P<0.01)，而CM组显著低于M组(P<0.05)。

表3 大鼠心肌组织相关信号通路蛋白质表达(H-score)

图6 大鼠心肌组织相关信号通路蛋白质表达水平Fig.6 Expression of signaling pathway proteins in myocardial tissue of rats

4 讨论

长时程、过度的运动应激使得心脏长时间保持较高的心输出量，心室长期过度扩张引发心肌纤维化，并逐渐发展成为慢性心肌损伤，心率失常风险明显增加[12]。Breuckmann等[13]利用磁共振延迟钆强化技术发现马拉松运动爱好者心肌纤维化发病率较高，易于普通人发生心肌损伤。Rao[10]造模长时程、大强度运动致大鼠心肌损伤发现，过度运动应激破坏了心肌组织ECM的合成与降解间的动态平衡状态，ECM沉积加剧，诱发心肌纤维化，同时血液中心肌损伤标志物cTNI浓度增加，心脏功能/组织形态/超微结构异常。体重变化可以反映运动强度对机体的影响。本研究结果显示，模型组大鼠由于训练强度超出机体所能承受的运动负荷，大量消耗能量物质，体重较对照组明显下降，同时心肌糖原容积分数增加，血清cTNI含量显著升高，心肌组织形态及超微结构亦发生病理性改变。说明本研究所采用6周跑台递增负荷训练方案由于过度运动应激使得大鼠心肌组织ECM过度沉积及反应性心肌纤维化，进而引发心肌功能/结构损伤。以上结果与前人研究结果一致。

慢性炎症反应的累积效应可引发心肌纤维化[14]。MAPKs族中主要成员p38 MAPK可以在转录水平或翻译水平调节相关基因表达或蛋白质合成，在炎症、细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用。Aschar-Sobbi等[12]发现小鼠在6周大强度运动训练后，p38 MAPK表达增加，小鼠心房出现巨噬细胞浸润，炎症因子TNF-α、IL-1β表达增加，心肌纤维化，同时再以p38 MAPK抑制剂干预后运动诱导的心房纤颤和纤维化得到抑制。NF-κB作为快速诱导转录因子在机体炎症反应中发挥主要作用，调控TGF-β1、TNF-α等炎症因子表达[15]。Stambe等[16]研究发现阻断p38 MAPK活化，可有效抑制肾组织的炎症损伤。TGF-β1是心肌纤维化主要诱导因子，过度表达可破坏心肌组织ECM合成与降解平衡：①诱导smad复合物的形成与入核，调控目标基因激活成纤维细胞，合成大量胶原蛋白等ECM组分，导致ECM过度沉积；②通过增强TIMP-1的表达，抑制MMP的活性，使ECM降解减少[17]。姜黄作用广泛，常被用于香料、食品添加剂和草药。姜黄素作为姜黄中具有生物活性的多酚提取物，对人体的健康益处主要体现在抑制炎症和抗氧化等方面[18]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中p38 MAPK及p-p38 MAPK/p38 MAPK虽未出现显著性变化，但呈现上升趋势，而p-p38 MAPK及NF-κB p65蛋白质表达显著上升，心肌纤维化因子TGF-β1及相关炎症因子含量升高，心肌ECM过度沉积；而训练过程中施以姜黄素干预后，与模型组比较，大鼠心肌p38 MAPK及p-p38 MAPK/p38 MAPK虽未出现显著性变化，但呈现下降趋势，p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白质表达显著下调，TGF-β1及相关炎症因子等含量随之降低，心肌ECM沉积得到缓解；同时心脏功能/组织形态/超微结构均得到有效改善。Topcu-Tarladacalisir等[19]对溃疡性结肠炎模型大鼠进行姜黄素干预后发现，p38 MAPK磷酸化水平下降，恢复MAPKs的免疫反应特性，减轻炎症反应及脂质过氧化程度。本课题组前期研究证实[8]，姜黄素可有效地抑制过度运动应激导致的大鼠肾脏炎症反应，下调TGF-β1等促炎因子含量，恢复ECM合成与降解平衡。综上可知，长期大强度训练过程中补充姜黄素可有效阻断运动性心肌纤维化的发生发展，其可能机制为姜黄素通过抑制心肌组织内p38 MAPK的过度活化，下调NF-κB p65的蛋白质表达，降低炎症因子特别是心肌纤维化诱导因子TGF-β1的合成与分泌，改善ECM合成与降解间的平衡，缓解心肌纤维化。

由此可见，姜黄素可以通过调控p38 MAPK/NF-κB信号通路，有效抑制长时程、大强度运动大鼠心肌炎症反应，缓解心肌纤维化，保护心脏结构/功能。