甜菜色素合成及理化性质研究

罗成飞，代翠红，吴玉梅

(1.黑龙江大学；2.哈尔滨工业大学化工与化学学院)

1 甜菜色素的特征

甜菜色素因最早发现于甜菜根中而得名。是一种含氮类生物碱类色素，具有水溶性[1]。因此甜菜色素易溶于水及乙醇，不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂，遇醋酸铅试剂会沉淀，并能被活性炭吸附，其颜色随pH的不同而会改变。天然色素的着色色调比较自然，更接近于天然物质的颜色。天然色素对光、热、氧、金属离子等很敏感[2]。甜菜色素中包含甜菜红素(betacyanin)和甜菜黄素(betaxanthin)两类。除了红甜菜，石竹目家族中，至少有9个种能合成甜菜色素。随着研究的深入，陆续发现真菌中也可以合成甜菜红素(Delgado-Vargas et al.2000)。甜菜红素与花青素虽然都是天然色素，都是次生代谢产物，但在被子植物中甜菜色素与花青素相互排斥。甜菜红素与花青素不能在同一植物中合成。花青素的合成前体之一乙酰CoA与甜菜色素的合成前体酪氨酸都来源于苯丙氨酸，两者的合成前体相同[3-4]。

甜菜红素表现出红色到紫色。甜菜红色素和黄色素的比率决定了色调。当组织受伤时甜菜色素就会大量产生。例如，通常红甜菜的叶子不是色素积累的正常场所，但在受伤和感染区域出现了甜菜色素的积累。食用红甜菜的根部色素含量最高，营养物质的含量也高，同时含糖率也最高，可能与甜菜色素的组织中防御机制有关。甜菜红素不同于花青素，甜菜红色素大多连结着葡萄糖形成甜菜苷。甜菜黄色素多与八种氨基酸之一相连。当甜菜红素的R-标记位置有其他的有机分子附着时也会导致颜色偏移[4]。甜菜色素通常作为食品添加剂、化妆品着色剂应用。甜菜色素是 L-酪氨酸的次级代谢物，色素的核心结构是甜菜醛氨酸。当甜菜醛氨酸与环多巴结合或者糖基化后，就生成了甜菜红素。而甜菜醛氨酸与氨基酸或胺结合，则生成甜菜黄素(见图1)。

图1 甜菜色素结构式

甜菜色素的生色团产生主要是甜菜醛氨酸。利用全波长扫描表明，甜菜红素的最大吸收波长在535 nm左右[5]，而甜菜黄素的特征吸收峰在 480 nm 处。甜菜红色素使植物的花瓣或叶片等组织呈现出红色到深紫的颜色变化。甜菜黄色素主要使植物呈现出黄色至橙色的颜色变化。目前，已有 50 多种甜菜红素和 31 种甜菜黄素被鉴定了出来[6,7]。

甜菜色素在 pH2.5～7.0 的环境下较为稳定(相对比花青素稳定)，但在碱性条件下不稳定。甜菜色素在高温环境条件下稳定性差，不宜与具有氧化和还原作用的物质同时使用，否则影响色素效果和生物活性。此外，甜菜色素与其他水溶性色素相似，其稳定性还受到光、金属离子、酶等因素的影响。当甜菜色素需要保存时应注意保存在低温、避光、酸性或中性、隔离氧化还原物质的环境中。研究表明，在能够合成色素的植物中某种情况下大多可以合成原花青素，进而合成花青素。但甜菜中由于缺少花青素合成酶，才导致其无法合成花青素[8]。

2 甜菜色素的理化性质

甜菜红素的主要成分是甜菜红苷，约占红色素的75～95%，其余为甜菜黄素、异甜菜苷、前甜菜红苷、异前甜菜苷以及甜菜色素的降解产物等。甜菜黄素包括甜菜黄素I和甜菜黄素II，均是一种吡啶衍生物。甜菜红素为红紫至深紫色液体、糊状物或粉末状。甜菜红素不溶于甘油、油脂等有机溶剂，难溶于醋酸、丙二醇溶剂却易溶于水[9,10]。

研究表明，甜菜红素的C14/C15位在催化剂存在的条件下会发生脱氢反应，生成新化合物，其颜色的色调也从红色转变成淡黄色。另外，引起甜菜红色素不稳定的主要原因还有当C14/C15位的脱氢和C17/C2位的脱羧时[11]。甜菜红素与甜菜黄素相比，甜菜黄素在过氧化物酶的作用下更容易被降解，也容易被被过氧化氢氧化。在过氧化物酶、葡糖苷裂解酶和多酚过氧化物酶的协同作用会轻易的发生甜菜红素的酶解。因此在甜菜色素提取过程中通过加热灭酶可以起到减轻甜菜红素降解作用。

甜菜红素的降解反应路径受pH的影响较为明显。在pH 6时，醛亚胺键水解增强；在pH4时，脱羧和脱氢类的降解途径成为主流。甜菜红素在pH 3-7之间相对稳定，当定量的色素加入到pH 2-9的溶液中时，可以观察到一个显著的红移现象[6]。甜菜色素在pH4.0～7.0范围内稳定；pH小于4.0或大于7.0时，溶液颜色由红变紫；pH超过10.0时，溶液颜色迅速变黄，此时甜菜红素转变成甜菜黄素。在有光和氧气存在的条件下，甜菜红素很容易降解。氧气在降解中起着关键作用，并且在存在光和高温条件下，这种作用更加明显。在氧介导的甜菜红素的降解反应中，不同的抗氧化剂具有不同的作用效果，酚醛和含硫的抗氧化剂都阻止甜菜红素的降解。在自然光或者紫外光的条件下，甜菜红素的生色团吸收了光，电子激发到了更高的能量状态，这会导致更高的反应性或更低的分子活化能[12]。但是，由光引起的色素的降解取决于氧的存在，因为在厌氧条件下通过光诱导的降解可以忽略不计。

3 甜菜色素的合成

3.1 常见甜菜色素

甜菜色素广泛存在于石竹目的藜亚目植物中，如，食用红甜菜、苋科的叶子花、马齿苋科的花瓣、仙人掌科的红瓤仙人掌果实和红瓤火龙果果皮果肉、鸡冠花、千日红、松叶菊、紫茉莉等。

3.2 甜菜醛氨酸的合成

1)酪氨酸羟化酶

甜菜醛氨酸的生成起始于芳香氨基酸 L-酪氨酸，在酪氨酸酶的催化下生成 L-多巴(L-DOPA)。酪氨酸酶是甜菜素合成过程的第一个关键酶，它是一个含 2 个 Cu 结合位点的蛋白，分子量一般在 40-70 kDa之间，高等植物中的酪氨酸酶既有酪氨酸羟化活性生成L-多巴，又具有氧化活性生成多巴醌。L-多巴的积累是产生甜菜醛氨酸的重要条件，这需要阻止 L-多巴被进一步被氧化成为多巴醌。在甜菜素代谢途径中还原剂是必不可少的，还原剂能有效地将多巴醌还原成 L-多巴，从而进一步反应成甜菜醛氨酸[13]。另外，滕晓鹿等[14](2016)发现过氧化氢酶-酚氧化酶也参与甜菜醛氨酸的合成，子粒苋(Amaranthus cruentus L.)来源的该酶具有酪氨酸酶的全部活性，对 L-酪氨酸的单酚氧化活性和对 L-多巴的双酚氧化活性，还具有过氧化氢酶活性，并在序列上确定了相应的活性位点，然而没有发现经典酪氨酸酶的铜结合位点。他们还发现该酶的表达水平与甜菜黄素的产量呈正相关，说明其主要参与甜菜黄素的合成而不是红素[15]。

2)多巴双加氧酶

L-多巴在第二个关键酶 4，5-多巴双加氧酶的催化下生成4，5-开环多巴。开环多巴稳定性差，继而由氨基和开环产生的醛基通过分子内缩合形成-甜菜醛氨酸，甜菜醛氨酸是甜菜素的骨架结构，也是甜菜色素的生色基团。多巴双加氧酶是一种，催化邻苯二酚衍生物开环并加上两个氧原子[16]多巴4,5-双加氧酶是一种非血红素铁蛋白，为外二醇环裂解酶，为同源二聚体，存在于植物组织细胞的胞浆中。马齿苋科植物大花马齿苋克隆出了高等植物的 4，5-多巴双加氧酶基因(PgDODA)，这类蛋白存在于产生甜菜素的植物中，也存在于其他被子植物和苔藓类植物体中。只是催化部位附近的序列稍有变化[17]。某些来源于非甜菜素生成植物的 DODA 酶在体外也表现出多巴双加氧酶活性，这些植物没有生成甜菜素是因为体内没有 L-多巴的存在。在大肠杆菌中成功表达了来源于紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)的Mj DODA 基因[18]，证实了 DODA 在体外的生物活性和甜菜醛氨酸的体外合成，在大肠杆菌中异源表达甜菜来源的 BvDODA 基因，体外酶活性实验表明，生成了甜菜醛氨酸，证实了开环多巴自发重排生成甜菜醛氨酸无论是体内还是体外，经过 DODA 酶催化得到的甜菜醛氨酸绝大部分是 S 型(95%)，这与天然甜菜素大部分为 S 构型相符[19]。RT-PCR 和转录组分析是目前发现和鉴定功能基因得主要手段，以此从巴朗岩马齿(Parakeelya mirabilis L.)的两个 DODA 相关序列中，鉴定出一个 PmDODA 参与了甜菜素的合成[20]。除植物来源的基因外，有报道利用大肠杆菌以 L-多巴为底物作体外酶活性实验，合成了甜菜醛氨酸[21]。

3.3 植物中甜菜红素合成途径

3.3.1 环多巴途径生成甜菜红苷配基

不同种类的甜菜红素是由甜菜红苷配基(环多巴甜菜醛氨酸)的糖基化衍生而来。在酪氨酸酶氧化活性的催化下，L-多巴被继续氧化成多巴醌，多巴醌上的氨基亲核攻击分子内部的环使其自发环化形成环多巴[22]，环多巴与甜菜醛氨酸结合自发反应生成甜菜红苷配基[23]。沉默甜菜中的细胞色素 P450 氧化酶CYP76AD1 后，不能生成甜菜红色素，只能生成甜菜黄素[24]。由此可知CYP76AD1 是环多巴合成酶。其同源基因CYP76AD5 和 CYP76AD6，只行使酪氨酸羟化酶活性生成 L-多巴，不能催化产生环多巴[25]。是否能形成环多巴是甜菜红素生成的重要条件。在所有行使酪氨酸酶活性的蛋白中，只有 CYP76AD1 能够合成甜菜红素。由于环多巴的不稳定性，很容易被酪氨酸酶继续氧化聚合生成黑色素。在产生甜菜素的植物细胞中，L-多巴的浓度会维持恒定，L-酪氨酸在甜菜色素形成之前会积累，在形成过程中会逐渐被消耗[26]。

3.3.2 甜菜黄素途径生成甜菜红苷配基

另一条生成甜菜红苷配基的路线可以通过甜菜黄素转化而来。这条途径是由酪氨酸和甜菜醛氨酸结合生成酪氨酸-甜菜黄素，被酪氨酸酶催化氧化成多巴-甜菜黄素。多巴-甜菜黄素还可由 L-多巴和甜菜醛氨酸结合生成，由酪氨酸酶氧化成多巴醌-甜菜黄素，最终经过一系列氧化反应生成甜菜红苷配基。实际上该反应路线其反应条件尚未清晰。还原剂是多巴-甜菜黄素的积累不可缺少，植物中多巴-甜菜黄素含量高的组织，其抗坏血酸的含量一般会达到较高水平[27]。

3.3.3 甜菜红苷配基的糖基化

甜菜红苷是甜菜红苷配基在 5 位羟基上的糖基化产物，由葡萄糖基转移酶催化 UDP-葡萄糖转移实现。5-O-葡糖基转移酶(5GT)分别从甜菜、苋菜和番杏科彩虹菊(Dorotheanthus bellidiformis L.)中鉴定出来。甜菜的 Bv5GT 特异性最强，苋菜和彩虹菊来源的 5GT 还能催化黄酮类的糖基化[28]。此外，甜菜红苷配基在 6 位羟基上的糖基生成千日红素 I，-O-葡糖基转移酶也从彩虹菊中被发现，其序列和 5-O-葡糖基转移酶基因序列明显不同，这两种酶在糖基转移过程中是相互独立起作用的[29]。Sasaki N，et al(2005)认为甜菜红苷生成的另一条可能途径是由5-O-环多巴糖基转移酶催化环多巴生成糖基化环多巴，糖基化环多巴再与甜菜醛氨酸反应得到甜菜红苷，该酶的活性已经在紫茉莉中得到证实[30]。

3.3.4 甜菜色素的生物合成

甜菜色素合成离不开酪氨酸，酪氨酸是甜菜色素的合成前体。在酪氨酸酶和 4，5-多巴加双氧酶的作用下酪氨酸生成甜菜醛氨酸。而甜菜醛氨酸是合成甜菜色素的关键中间产物(见图2，图3)。甜菜醛氨酸是甜菜红素的基本生色集团，也是甜菜红素的重要结构组成部分。甜菜醛酸与环-DOPA-葡萄糖苷结合生成甜菜红素，与胺结合生成甜菜黄素[31]。

图2 甜菜色素的合成途径(引自：Tanaka Y，et al.2008; Gandia-Herrero F.et al.2013)

图3 甜菜素的生物合成途径 引自YU Si-li,LIU Xue ,et al.2018

3.3.5 甜菜黄素的合成

甜菜醛氨酸和不同的胺或氨基酸分子缩合可以生成不同的甜菜黄素。这一步通常被认为是自发反应，胺或氨基酸的氨基和甜菜醛氨酸的醛基发生亲核加成，最终脱去一份子水形成亚胺[32]。由于植物中胺和氨基酸的多样性，很难确定天然甜菜黄素的确切数量。不同植物中氨基酸含量的差异决定了其体内主要甜菜黄素的种类，如紫茉莉中多巴胺-甜菜黄素和酪胺-甜菜黄素含量最多，大花马齿苋中酪氨酸-甜菜黄素和甘氨酸-甜菜黄素含量最多，梨果仙人掌中主要是脯氨酸-甜菜黄素。甜菜植物中的 CYP76AD1 酶将多巴催化合成环多巴，比氨基酸更容易和甜菜醛氨酸结合生成甜菜红苷配基，进而被糖基化成甜菜红苷，因此在甜菜中主要是甜菜红苷而不是甜菜黄素。甜菜黄素的糖基化在自然界中极其罕见，最近在转基因烟草中发现了一种糖基化甜菜黄素-多巴-甜菜黄素己糖苷[33]。

4 甜菜色素结构与稳定性

甜菜醛氨酸到甜菜黄素的转换是由于醛氨酸与一个氨基化合物的缩合，甜菜红素的形成是环-多巴[环-3-(3,4-二羟基苯)]的缩合。这些结构变化影响着色素的稳定性。研究表明，甜菜红素在室温以及加热条件下都比甜菜黄素的稳定性更高[34-35]。在甜菜的这两种色素之间，甜菜黄素容易发生更高的氧化，因而在pH酸性下比甜菜红苷更不稳定。另一项研究表明，热处理条件下甜菜红苷的半衰期值比vulgaxanthin I高11倍[36]。大部分的甜菜红色素稳定性的研究都集中在甜菜红苷(图4)，他是在甜菜中含量最丰富的甜菜红素。多种多样结构不同的甜菜红素是5-O-或6-O-葡萄糖苷发生糖基化反应或者酰化反应的结果[37]。

图4 甜菜红苷的主要降解产物(Based on Herbach et al. 2006)

对于甜菜黄素和甜菜红素，其最大吸收是受甜菜红苷配基骨架的特定取代模式所影响。甜菜红素的情况下，甜菜红苷配基(糖苷配基)的糖基化的发生会带来蓝移，其中观察到葡萄糖连接在C6上比C5C糖基化效果更明显[38]。研究发现，一般情况下脂肪族对甜菜红素的最大吸收几乎没有影响，而芳香族的酯化会导致红移[39-40]。

有关甜菜色素稳定性的最早研究表明甜菜苷可能通过水解发生降解后形成甜菜醛氨酸和环DOPA5-O-葡糖苷。然而，一部分降解的甜菜苷在热提取的冷凝阶段的低温储藏可以得到改变[41]。甜菜苷在高温下暴露引起异构化和脱羧反应，分别形成C15-立体异构体异甜菜苷和15-脱羧甜菜红苷[42]。随着研究手段、方法、研究技术的不断进步，最近的研究表明，在甜菜红素C14/C15位的脱氢会导致相应的新化合物的形成，从而引起由红色到浅黄色色调的转变。据报道，在C17和/或C2位的脱羧以及在C14/C15位的脱氢，在使色素不稳定方面有更重要的作用(图5)。在甜菜红素中，C19，C20和连接于C2的羧酸基团是更容易脱羧的位点，而C2，C3，C14和C15之间的键则更易脱氢[37，43]。

图5 甜菜红素中易于降解的官能团

甜菜红素与脂族酸的酯化可以提高其稳定性。此外，用芳族酸取代也可以通过降低化合物的易感性水解附着来增强色素的稳定性。从化学的角度来看，6-O位置的取代基与5-O位置的取代基相比可以更有效地增加稳定性[23]。另外一个增强甜菜红苷稳定性的重要因素是色素分子本身的浓度，就像在甜菜红素中观察的一样。