东胜砂岩型铀矿床中细菌多样性研究

耿 海 波

(石家庄职业技术学院 食品与药品工程系，河北 石家庄 050081)

成矿作用是指在地球的演化过程中，使分散存在的有用物质(化学元素、矿物、化合物)富集而形成矿床的各种地质作用[1].人们对于成矿作用的研究多侧重于物理因素和化学因素，虽然生物因素在成矿作用中的研究正逐渐受到重视，但仍有大量的生物矿化机制未被阐明[2].铀既是一种高效清洁的能源，又是一种关系到国家安全的战略资源.长期以来，人们将铀的成矿作用视为由硫化物、氢气或其他还原剂通过物理和化学作用还原U(VI)所致，认为即使存在生物成矿因素，也只起间接作用[3].文献[4]揭示了某些细菌能够将U(VI)还原为U(IV) ，开辟了研究铀和微生物相互作用的新时代.为重新认识砂岩中卷型矿床的成矿机制，掀起了旨在修复铀污染水环境的铀-微生物作用的实验研究热潮[5-6].国外有关铀生物成矿作用的实验研究主要集中在微生物与有机质的关系(间接成矿)、微生物富集铀(直接成矿)的人工合成实验等方面[7-9].国内对于铀的生物成矿作用的研究主要集中在新疆十红滩砂岩型铀矿上，对于鄂尔多斯盆地北部东胜铀矿的生物成矿研究主要集中在铀矿石中微化石推论[10]和脂肪酸生物标志的间接推断[11]上，但这些研究均利用岩石样品的间接生物检测指标对铀的生物成矿作用进行推测，缺乏活体微生物参与成矿的直接证据.利用微生物学方法研究铀矿床的不同区域岩石中存在的微生物种类及其分布规律，并结合其生理、生化特点研究微生物和矿床之间的相互作用，是探究生物成矿作用的主要方法之一.本文对东胜砂岩型铀矿不同区域岩石采样后，通过对其中细菌的富集、分离，来鉴定矿床中存在的各类活体细菌，研究其种类和分布规律，并对产生此分布规律的原因进行探讨，以确定此铀矿床中的优势菌群，为进一步开展铀的生物成矿作用研究提供技术参数.

1 材料与方法

1.1 岩石采样与处理

在鄂尔多斯盆地北部东胜砂岩型铀矿的不同区域用无菌采样装置进行采样，将样品置于无菌采样袋中，送生物实验室进行菌体的富集、分离与纯化，并进行鉴定.

样品取回后，在超净工作台用无菌刀剥除2 cm厚岩石表层，去除岩石样品表面的污染物，取岩芯部分在研钵中研磨至沙砾状，定量称取后置于不同的培养液中，在恒温培养箱中进行富集培养.

本研究所用6个代表性的岩石样品，分别采自鄂尔多斯盆地北部东胜地区中侏罗系直罗组的各个亚带，样品的基本地球化学参数见表1.

表1 样品特征一览表

1.2 各类细菌培养基的配制[12]

1.2.1 硫酸盐还原菌(STK)

磷酸氢二钾0.05 g、氯化铵0.10 g、硫酸钠0.10 g、二水氯化钙0.01 g、七水硫酸镁0.20 g、 70%的乳酸钠溶液0.5 mL、蒸馏水100 mL，pH值控制在7.5.单独配制含量为1%的硫酸亚铁铵溶液，在使用培养基前，加5 mL至培养基内.

1.2.2 铁细菌

硝酸铵0.05 g、硝酸钠0.05 g、磷酸氢二钾0.05 g、七水硫酸镁0.05 g、六水氯化钙0.02 g、柠檬酸铁铵1.00 g、蒸馏水100 mL，pH值控制在7.0.

1.2.3 氧化硫硫杆菌

硫酸铵0.02 g、磷酸二氢钾0.30 g、七水硫酸亚铁0.001 g、七水硫酸镁0.05 g、氯化钙0.03 g、蒸馏水100 mL、硫磺粉1.00 g，pH值控制在3.0.

1.2.4 排硫硫杆菌

五水合硫代硫酸钠0.50 g、氯化铵0.01 g、碳酸氢钠0.10 g、磷酸氢二钠0.02 g、六水合氯化镁0.01 g、蒸馏水100 mL，pH控制在7.0.五水合硫代硫酸钠和碳酸氢钠单独用少量水溶解后灭菌，使用前再加入到其他已灭菌的成分中.

1.2.5 氧化亚铁硫杆菌

硫酸铵0.015 g、氯化钾0.005 g、磷酸二氢钾0.05 g、七水硫酸镁0.05 g；硝酸钙0.001 g、蒸馏水100 mL、10%的七水硫酸亚铁1 mL，pH值控制在3.0.

1.2.6 亚硝化细菌

硫酸铵0.20 g、磷酸二氢钾0.10 g、七水硫酸镁0.05 g、氯化钠0.20 g、七水硫酸亚铁0.04 g、碳酸钙0.50 g、蒸馏水100 mL，pH值控制在7.2.

1.2.7 硝化细菌

硝酸钠0.10 g、无水碳酸钠0.10 g、氯化钠0.05 g、磷酸二氢钾0.05 g、七水硫酸镁0.05 g、七水硫酸亚铁0.04 g、蒸馏水100 mL，pH值控制在7.5.

1.3 各类细菌的计数方法

1.3.1 硫酸盐还原菌

分别取10 g，1 g，0.1 g粉碎后的岩石样本，接种到100 mL培养基中，每一添加量平行接种到5根试管中，置37 ℃恒温培养箱中培养.隔氧培养5 d后记录实验现象为阳性的试管数，查MPN(most probable number，译为最可能数)检索表，计算单位质量岩石样本中的微生物MPN值[13].

1.3.2 其他细菌

采用稀释平板计数法计数.

1.4 各类细菌的富集、分离和纯化[12]

1.4.1 硫酸盐还原菌

称取无菌粉碎后的岩石样品10 g，加入对应液体培养基中，置于厌氧培养箱中28 ℃恒温培养，产生黑色沉淀现象的可判断为硫酸盐还原菌阳性.取1 mL菌液，接种到无硫酸亚铁铵的液体培养基中，隔氧培养5 d后，用混合倒平板的方式接种到固体培养基中，隔氧密封，置28 ℃厌氧培养箱中培养，观察出现黑色菌落后，挑取单菌落得到纯培养.

1.4.2 铁细菌

称取无菌粉碎后的岩石样品10 g，加入对应液体培养基中，避光恒温18 ℃～20 ℃培养7 d～10 d，直至出现松软的灰色絮状物，当灰色絮状物变为赭黄色后制成水浸片，在盖玻片上加浓度为2%的铁氰化钾和10%盐酸溶液各一滴，用滤纸吸去多余水分后放大1000倍镜检，若菌体呈蓝色，则证明所培养物为铁细菌.采用固体平板连续划线的方法将其分离纯化，得到的单菌落移接入固体斜面培养基中保存.

1.4.3 硫杆菌

称取无菌粉碎后的岩石样品10 g，加入到对应液体培养基中，在28 ℃富集培养7 d～10 d，将分离得到的硫杆菌接种到硅胶固体平板上，挑取单菌落得到纯培养.

1.4.4 硝化细菌

称取无菌粉碎后的岩石样品10 g，分别接种到亚硝化细菌和硝化细菌培养液中，置于30 ℃恒温培养箱中培养7 d～10 d.将分离得到的细菌分别接种到硅胶固体平板上，挑取单菌落得到纯培养.

1.5 各类细菌的鉴定

按照《伯杰细菌鉴定手册》[14]进行鉴定.

2 结果与分析

2.1 岩石样品中细菌的分离鉴定结果

2.1.1 硫酸盐还原菌

在不同岩石样品中加入培养基，经无氧培养后，产生黑色菌落，挑取单菌落分离、纯化得到硫酸盐还原菌.镜检其形态为杆状或弧状，Gram染色呈阴性，它可将硫化物还原产生H2S，其最适宜生长温度为37 ℃.依据文献[14]，对分离得到的菌株进行观察和理化性质测定，结果见表2-3.

表2 脱硫弧菌属特征与分离菌株

表3 脱硫肠状菌属特征与分离菌株

由表2-3可以看出，各亚带岩石样品中存在分属于脱硫弧菌属和脱硫肠状菌属的硫酸盐还原菌.其中，脱硫弧菌属分布在氧化带和弱氧化带，而脱硫肠状菌属的东方脱硫肠状菌在3个亚带均有分布.究其原因在于，脱硫肠状菌在特殊环境下可以形成抗逆性极强的芽孢，有利于菌体适应外界的高温、高压、辐射、毒性等不良环境，为菌体于矿床中生存提供保障.脱硫肠状菌在东胜砂岩型铀矿和新疆十红滩砂岩型铀矿中的分布情况[15]有相似之处.

另外，菌体的分布和矿石的品位也有一定的关联.所采岩石样品含铀量较高，而铀的放射性可能会影响硫酸盐还原菌的生长和繁殖；岩石中的含碳量低，能在很大程度上抑制硫酸盐还原菌的生长，所以菌体种类较少.

微生物的分布和环境因素也有相互作用.硫酸盐还原菌对矿床的形成和矿床中铀含量对硫酸盐还原菌的影响这两方面谁起更主要的作用，尚有待进一步探讨.

2.1.2 铁细菌

铁细菌可以利用Fe(Ⅱ)为营养，将之氧化成Fe(Ⅲ)，从而形成高价铁离子，进而导致沉淀出现，并从中获得自身生长所需要的能量.笔者从不同岩石样品中分离得到了多株菌落特征明显的铁细菌，对其形态进行镜检，并根据文献[14]对其进行鉴定至属，结果见表4.

表4 铁细菌的特征与分类

由表4可以看出，铁细菌在矿床中的分布比较普遍，尤其是在含碳量高的氧化带种类较多，而矿石带所含铁细菌种类单一，可能是高浓度铀对铁细菌产生抑制作用的结果，具体原因有待于进一步探索.

2.1.3 硫杆菌

对各岩石样品中的硫杆菌进行分离、纯化，共分离出两种不同的硫杆菌，按照文献[14]进行鉴定，结果见表5.

由表5可以看出，在氧化带存在少量排硫硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌，弱氧化带仅有氧化亚铁硫杆菌存在.

表5 硫杆菌的特征与分类

2.1.4 硝化菌

对各岩石样品中的硝化细菌进行分离、纯化，结果仅在氧化带岩石中分离出两类硝化细菌，按照文献[14]进行鉴定，结果见表6.

表6 硝化菌的特征与分类

由表6可以看出，仅在氧化带分离得到了硝化菌，它们分属于两个菌属，说明仅有氧化带环境适合硝化菌的生长.

2.2 各类细菌的分布规律

为考察东胜砂岩型铀矿床中细菌的分布规律，对不同岩石样品中的各属细菌进行定量测定，结果见表7.

表7 东胜砂岩型铀矿样品中微生物分布及数量 个/g

由表7可以看出，各亚带岩石样品中细菌的种类和数量有明显的差异.

氧化带细菌种类和数量最多，铁细菌和硫酸盐还原菌为优势菌群.由于该区域矿石碳元素供给充裕，所以铁细菌和其他菌十分活跃，它们发育旺盛，繁殖较快，在围岩内部创造了适合各类微生物生长繁殖的微环境，也为厌氧的硫酸盐还原菌的生长和代谢创造了条件[12].

弱氧化带细菌的种类和数量相对较多，铁细菌与硫酸盐还原菌均存在，但相对而言，铁细菌数量减少，硫酸盐还原菌数量增多，硝化细菌未检出.这应与岩石样品含碳量下降、含铀量增加及其所处的地球化学区域环境相关.

矿石带主要的细菌类群为厌氧的含芽孢硫酸盐还原菌，这是因为这个区域含铀量高，含碳量较低，不利于普通细菌的生长，也说明芽孢对于抵抗不良环境具有很大的作用，是硫酸盐还原菌可以广泛分布的主要原因.

各岩石样品中均分离得到了铁细菌和含芽孢硫酸盐还原菌，说明它们是东胜铀矿岩石中的优势菌群，是铀矿形成中除了理化因素外的重要生物因素.

3 结论

(1) 东胜砂岩型铀矿床容矿层岩石中细菌分布广泛，种类多样.

(2) 不同亚带岩石中主要细菌类群的分布特征不同，呈现出明显的区域差异性.

(3) 硫酸盐还原菌和铁细菌是整个矿床中的优势菌群，具有芽孢的脱硫肠状菌分布最为广泛，在各亚带均有分布；硫杆菌和硝化菌在各亚带分布不均.这些变化规律与各亚带的地质环境、碳含量、铀品位有关.

(4)不同种属的硫酸盐还原菌对成矿的贡献有待于采用模拟实验进一步验证.