超声波辅助提取柚树叶黄酮及其抗氧化、抑菌能力研究

丘苑新 张泽雄 何 娣 蔡健常 柳建良

(仲恺农业工程学院现代农业工程创新研究院，广东 广州 510225)

柚子[Citrusmaxima(Burm)Merr.]属于芸香科柑橘属，有着“天然水果罐头”之美誉[1]，其气味芬芳，口感酸甜，具有极高的营养及药用价值[2]。柚树叶富含精油、黄酮等物质，其中黄酮类化合物具有抑制多种细菌、真菌、病原体等致病微生物的作用，还具有抗肿瘤的作用，被广泛应用于临床上[3-4]。此外，黄酮类化合物还能与其他药物、维生素等复配发挥协同作用，显著提高其生物活性[5]。常见的黄酮提取方法有超声波辅助提取法[6]、超临界提取法[7]、有机溶剂提取法[8]、微波辅助提取法[9]及碱提酸沉法[10]。超声辅助提取法是一种高效、环保的提取技术，常用于提取热不稳定性的成分[11]，周旋等[12]通过超声辅助法提取女贞子总黄酮并进行抗氧化活性研究；Luis等[13]采用超声辅助提取藤黄总黄酮并将其提取率提高了3倍以上。目前，有关柚树叶的研究主要集中在精油的提取方面，如郭刚军等[14]运用超临界萃取柚树叶精油并进行GC-MS分析；黄桂平等[15]采用微波辐射法提取柚树叶香精油，其得率达1.03%；Tan等[16]通过微波辅助水解法提取柚树叶精油，并采用响应面法进行工艺优化。而关于柚树叶黄酮的报道较少，如周梦春等[17]仅对柚树叶黄酮含量进行了测定，但并未进行提取工艺优化与抗氧化、抑菌性能研究。研究拟以柚树叶为原料，通过超声辅助法提取总黄酮，优化其工艺条件，并对提取物的抗氧化和抑菌能力进行探索，以期为更全面地开发利用柚树叶黄酮提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜柚树叶：采自广东梅州市；

芦丁标准品、铁氰化钾、磷酸盐缓冲液(pH 6.82)：分析纯，上海源叶生物技术有限公司；

无水乙醇、石油醚、氯化铝、氯化铁：分析纯，广州化学试剂厂；

三氯乙酸：分析纯，天津市百世化工有限公司；

亚硝酸钠：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；

抗坏血酸：分析纯，广东光华科技股份有限公司；

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌：仲恺农业工程学院微生物实验室；

超声波清洗机：YL-040S型，深圳市聚众发商贸有限公司；

旋转蒸发仪：：RV10型，武汉集思仪器设备有限公司；

生化培养箱：SPX-150型，上海悦丰仪器仪表有限公司；

低速离心机：SC-3610型，安徽中科中佳科学仪器有限公司；

分光光度计：UV-1800PC型，太原衡天力科贸有限公司；

高压灭菌锅：YXQ-LS-50SII型，上海博讯实业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 柚树叶总黄酮提取工艺流程

柚树叶清洗→65 ℃烘干至恒重→粉碎→取2.0 g样品用乙醇浸提总黄酮(40 ℃、功率240 W)→减压抽滤→离心(5 000 r/min、10 min)→测定上清液吸光度(510 nm)→石油醚脱脂、脱色→旋转蒸发(50 ℃)→冷冻干燥

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制 根据文献[18]并修改：精确称取2.5 mg芦丁标准品溶于25 mL体积分数为90%乙醇溶液中，制得0.1 mg/mL的芦丁储备液。分别吸取芦丁储备液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL质量分数为5%的NaNO2溶液摇匀并静置6 min；加入0.3 mL质量分数为5%的Al(NO3)3溶液摇匀并静置6 min；加入4.0 mL浓度为1 mol/L的NaOH溶液并用体积分数为30%乙醇溶液定容，摇匀，静置15 min。以未加芦丁标准液的反应溶液作为参比溶液，测定510 nm处吸光度；以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得y=15.160x+0.006，R2=0.999 8。

1.2.3 柚树叶总黄酮提取量的测定 精确吸取1 mL柚树叶提取液，按式(1)计算总黄酮提取量。

(1)

式中：

g——总黄酮提取量，mg/g；

c——总黄酮质量浓度，mg/mL；

n——稀释倍数；

m——柚树叶干粉质量，g。

1.2.4 单因素试验

(1)乙醇体积分数：固定提取时间40 min、料液比(m柚树叶∶V乙醇)1∶20(g/mL)，探究乙醇体积分数(50%，60%，70%，80%，90%)对总黄酮提取量的影响。

(2)提取时间：固定乙醇体积分数60%、料液比(m柚树叶∶V乙醇)1∶20(g/mL)，探究提取时间(20，30，40，50，60 min)对总黄酮提取量的影响。

(3)料液比：固定乙醇体积分数60%、提取时间40 min，探究料液比[1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30(g/mL)]对总黄酮提取量的影响。

1.2.5 正交试验 在单因素试验基础上，选取提取时间、乙醇体积分数和料液比为因素进行正交试验设计，以确定柚树叶黄酮的最佳提取工艺。

1.2.6 抗氧化能力

(1)样品制备：取最优提取工艺下的提取液，加入25 mL 石油醚重复萃取3次，以除掉色素与脂溶性物质，旋转蒸发以除掉乙醇和石油醚，冷冻干燥得黄酮类化合物干粉。用体积分数为30%乙醇溶解提纯后的黄酮类化合物干粉，配制成黄酮类化合物质量浓度为0.147 mg/mL的溶液，同时配制总黄酮质量浓度为0.147 mg/mL未除杂的提取液与0.147 mg/mL的抗坏血酸溶液作为对照。

(2)总还原力测定：根据文献[19]并修改。分别吸取样品液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于15 mL离心管中，用蒸馏水将各离心管液体补足至1 mL，复配溶液中黄酮质量浓度依次为0.000，0.029，0.059，0.088，0.118，0.147 mg/mL，依次加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.82)2.5 mL，摇匀，加入质量分数为1%的K3[Fe(CN)6]溶液2.5 mL，摇匀，50 ℃水浴20 min，加入体积分数为10%的CCl3COOH溶液2.5 mL，3 000 r/min离心10 min。分别取离心后上清液2.5 mL于10 mL试管中，加入质量分数为0.1%的FeCl3溶液0.5 mL，定容至10 mL，摇匀，静置15 min。以未加样品液的反应溶液作为参比溶液，测定700 nm处吸光度。

1.2.7 抑菌能力

(1)柚树叶提取液的制备：取除色脱脂后的黄酮类化合物干粉，用体积分数为30%乙醇溶解，配成黄酮类化合物质量浓度为0.147 mg/mL，同时配制总黄酮质量浓度为0.147 mg/mL的未除杂提取液作为对照。

(2)菌悬液制备：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌经两次活化，菌液用生理盐水稀释，于血球计数板计数，选取菌液浓度为(1×106～4×106CFU/mL，接种时，将菌液浓度稀释至106CFU/mL。

(3)抑菌圈测定：采用牛津杯法[20]。以体积分数30%乙醇为空白对照，青霉素为阳性对照。

(4)最低抑菌浓度：采用二倍稀释法[21]，将柚树叶黄酮类化合物提取液用体积分数30%乙醇稀释为原液的100.0%，50.0%，25.0%，12.5% 4个浓度，观察各提取液浓度下的培养皿是否出现抑菌圈。

1.3 数据处理

运用SPSS 25.0、Origin 9.5软件进行数据处理及图形绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对柚树叶黄酮提取量的影响 由图1 可知，柚树叶总黄酮提取量随乙醇体积分数的增加呈先升高后降低趋势，最高达到10.24 mg/g。当乙醇体积分数为50%～80%时，柚树叶总黄酮提取量逐渐升高，可能是随着乙醇体积分数的增加，醇溶性黄酮类化合物加速溶解[22]。继续增大乙醇体积分数，总黄酮提取量减小，说明乙醇体积分数较大时，溶剂的极性降低，大量的脂溶性和醇溶性成分溶出，黄酮类化合物溶解度降低，从而导致总黄酮提取量减小[23]。因此，提取柚树叶总黄酮的乙醇体积分数以80%为宜。

图1 乙醇体积分数对黄酮提取量的影响

2.1.2 提取时间对柚树叶黄酮提取量的影响 由图2可知，总黄酮提取量随提取时间的延长先增加后减少。当提取时间为20～50 min时，柚树叶细胞壁逐渐被破坏，黄酮类物质在超声波作用下不断溶出并在50 min时全部溶出，故总黄酮提取量逐渐增加[24]；若继续延长提取时间，长时间的超声会使黄酮结构发生破坏或者发生降解使提取率下降[25]。因此，提取柚树叶总黄酮的提取时间以50 min 为宜。

图2 提取时间对黄酮提取量的影响

2.1.3 料液比对柚树叶黄酮提取量的影响 由图3可知，随着料液比的增加，总黄酮提取量不断升高。随着溶剂的增加，柚树叶粉末与溶液更加充分接触，黄酮析出速率加快，黄酮提取量逐渐升高；当料液比(m柚树叶∶V乙醇)<1∶20(g/mL)时，黄酮提取量显著提高；当料液比(m柚树叶∶V乙醇)>1∶20(g/mL)时，黄酮提取量不仅增加缓慢，而且会大大增加提取成本[26]。因此，最佳的料液比(m柚树叶∶V乙醇)为1∶20(g/mL)。

图3 料液比对黄酮提取量的影响

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，选取乙醇体积分数、提取时间和料液比为因素，总黄酮提取量为响应值进行三因素三水平正交试验设计。因素水平表见表1，正交试验设计与结果见表2。

表1 因素水平表

由表2可知，柚树叶总黄酮提取量的主次因素为乙醇体积分数>提取时间>料液比，最佳提取条件为A3B3C2，即乙醇体积分数80%、提取时间50 min、料液比(m柚树叶∶V乙醇)1∶25(g/mL)。最佳提取条件下进行3次平行试验，测得总黄酮提取量平均值为11.746 mg/g，高于正交试验中的任一结果，符合最优条件，表明正交试验得出的最佳工艺结果具有可靠性。

表2 柚树叶总黄酮提取正交试验设计与结果

2.3 抗氧化能力

由图4可知，随着样品液质量浓度的升高，其总还原能力逐渐增强，证明该抗氧化活性的样品与其添加量有良好的量效关系。未除杂的提取液总还原力约是初步除杂样品液的50%，当样品质量浓度>0.088 mg/mL时，抗氧化活性随样品质量浓度的增加逐渐趋于平缓，可能是未除杂的提取液中含有色素及脂类的干扰，降低了其抗氧化活性。而除去色素与脂类的样品液，其总还原力略高于抗坏血酸，约是同等质量浓度抗坏血酸的1.25倍。初步除杂后的提取液在高浓度时依然能保持较好的还原能力，若进一步提纯柚树叶黄酮类化合物，其抗氧化能力将会更强。

图4 总还原力测定结果

2.4 抑菌能力

由表3可知，柚树叶黄酮类化合物提取液在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌的培养基中均出现了抑菌圈，其对3种菌有一定的生长抑制作用。未经除杂的提取液抑菌效果较差，金黄色葡萄球菌表现为中度敏感、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌表现为低度敏感，但有抑菌圈出现，说明仍有一定抑菌效果。而除掉色素和脂类物质的提取液抑菌效果较好，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出高度敏感，鼠伤寒沙门氏菌表现出中度敏感。3种细菌对于同等质量浓度的青霉素均表现出高度敏感，在总体抑菌活性上：青霉素>提取液(除色素和脂类)>提取液(未经处理)>体积分数30%乙醇；柚树叶黄酮提取液的最低抑菌质量浓度(MIC)为 0.074 mg/mL。

表3 柚树叶黄酮类化合物的抑菌效果

3 结论

试验表明，通过正交试验优化的柚树叶总黄酮最佳工艺条件为：乙醇体积分数80%，超声时间50 min，料液比(m柚树叶∶V乙醇)为1∶25(g/mL)，此条件下总黄酮提取量为11.746 mg/g。柚树叶总黄酮提取液的质量浓度越大，其总还原力越强，经除去色素、脂类的柚树叶总黄酮提取液的总还原力高于未经处理的提取液和抗坏血酸，是抗坏血酸的1.25倍。总黄酮提取液的抑菌效果与其质量浓度呈正相关，其对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌具有不同程度的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌质量浓度为0.074 mg/mL。综上，柚树叶总黄酮具有良好的抗氧化和抑菌能力，后续将对其他方面的性质进行进一步研究。