冷链米饭多尺度结构的变化及慢消化淀粉形成机制

王丽丽 赵思明 林亲录 程云辉 周梦舟 张宾佳

(1.华中农业大学，湖北 武汉 430070；2.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；3.长沙理工大学，湖南 长沙 410114；4.湖北工业大学，湖北 武汉 430068)

随着冷链物流行业的迅速发展，冷链食品已占据中国食品市场的25%以上[1]。作为简便经济、即开即食、食用人群广泛的冷链产品，冷链米饭是将蒸煮后米饭的中心温度迅速降低至10 ℃以下，并在后续的各个流通环节中使米饭中心温度保持在10 ℃以下的方便主食。感官品质及营养品质优良的冷链米饭具有十分广泛的市场需求，但冷链米饭中的淀粉往往呈现较高的消化速率及快消化组分含量，致使餐后血糖水平高，易于加剧肥胖、糖尿病等代谢性疾病的风险[2-3]。因而，适宜降低淀粉的消化速率对生产低血糖指数的高品质冷链米饭具有重要意义。

米饭主要是由淀粉、蛋白质等营养组分构成的凝胶体系，组分分子在不同尺度组装形成短程有序结构、结晶结构、纳米结构和凝胶网络，决定着米饭中淀粉的消化特性。前期研究显示，米饭中淀粉长链比例的增加，有利于降低淀粉的消化速率[4]，而且其有序晶体含量越多、非周期性结构越致密，慢消化淀粉的含量越高[5-6]。实际上，冷链米饭在流通与消费过程中往往历经3 d以内的低温贮藏；且已有研究[7-8]表明贮藏过程可诱导蒸煮后的凝胶态淀粉链段组装形成螺旋、结晶等结构，从而改变淀粉的消化速率、慢消化组分含量等特征。据此分析，控制冷链米饭的贮藏时间等条件因素可修饰米饭的多尺度结构，进而调控冷链米饭中淀粉的消化特性。然而，目前关于冷链米饭的研究多集中于加工及配送过程中的产品品质的变化[9-13]，仍未系统揭示冷藏过程如何影响米饭的多尺度结构及淀粉消化特性。

试验拟以冷链籼米饭为研究对象，利用体外消化方法考察冷藏时间对米饭的淀粉消化速率和慢/抗消化淀粉含量的影响，综合运用扫描电镜、小角X射线散射、X射线衍射、红外光谱等技术，研究冷链贮藏过程中米饭的微观质地、纳米结构、结晶结构、短程有序结构等不同尺度结构的变化。在此基础上，从米饭多尺度结构水平探讨短期贮藏(时间为1 d)如何强化米饭中慢消化淀粉组分的形成，为冷链米饭的淀粉消化特性调控及营养品质提升建立了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

大米：桃花香米，淀粉含量为83.98%(干基)，襄阳赛亚米业有限公司；

消化酶：A3176型α-淀粉酶(活性25 U/mg)和10115型葡萄糖苷酶(活性64 U/mg)，美国Sigma-Aldrich公司；

F006-1-1型葡萄糖试剂盒：南京建成生物有限公司；

其余化学试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

电饭煲：CFXB50FC5-85型，浙江苏泊尔股份有限公司；

集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S型，武汉科尔仪器设备有限公司；

真空冷冻干燥机：FD-1A-50型，北京博医康实验仪器有限公司；

生物扫描电镜：JSM-6390型，日本NTC公司；

傅里叶变换红外光谱仪：IS50型，美国Thermo Scientific公司；

X射线衍射仪：D8 ADVNCE型，德国布鲁克AXS有限公司；

小角X射线散射仪：NanoSTAR型，德国Bruker-AXS公司。

1.2 方法

1.2.1 冷链米饭的制备 称取300 g大米于电饭煲的内锅中，用蒸馏水淘洗一遍，按照m米∶V水=1.0∶1.3(g/mL)加入去离子水，利用“精煮模式”进行蒸煮，经蒸煮后米饭的水分质量分数为55.04%。将米饭冷却至37 ℃，称取30 g新鲜米饭置于液氮中冷冻并进行冷冻干燥，将其余米饭按照30 g/份的量分别置于4 ℃ 的冷链环境中贮藏1～3 d，利用液氮冷冻后进行冷冻干燥。冻干后的米饭保留部分完整的米饭粒，其余样品粉碎并过40目筛，置于干燥器中备用。

1.2.2 扫描电子显微镜(SEM) 利用镊子将待测的冻干米饭粒掰开，横断面向上置于粘贴有双面导电胶的样品台上，并将样品台置于离子溅射镀膜仪中镀金，取出样品台并置于样品室中进行观察和拍照，仪器工作电压为15 kV，样品的放大倍数为2 000倍和5 000倍。

1.2.3 小角X射线散射(SAXS) 参照文献[14]并适当改动，以含水量80%的粉碎米浆为测试样品，测试前将样品在26 ℃平衡2 h，然后将样品置于样品台上，采用Pilatus 1M检测器采集样品的散射数据，检测时间为10 s。以水作为背景，对获得的数据进行背景扣除和归一化处理。样品数据散射角度q的范围为0.1～5.0 nm-1。

1.2.4 X射线衍射(XRD) 参照文献[15]，将预先平衡好水分的米饭粉末置于样品池中，利用X射线衍射仪检测样品的衍射数据，扫描区域为5°～35°、步长0.02°、步速1 s，光源为0.154 2 nm波长的单色Cu-Kα X射线，测试管压30 mV、管流20 mA。

1.2.5 傅里叶变换红外光谱(FTIR) 将样品置于傅里叶红外光谱仪的衰减全反射附件上，在4 cm-1的分辩率下采集样品在400～4 000 cm-1波数范围的谱图，扫描次数为32次。以空气作为背景，使用OMNIC软件对所获得的红外光谱图进行基线校正、归一化处理以及去卷积处理(增强因子为1.9、半峰宽为19 cm-1)，然后计算995 cm-1和1 022 cm-1处峰强度的比值。

1.2.6 体外消化特性 参照文献[7]，称取含有90 mg淀粉的米饭粉末并置于含有6 mL醋酸钠缓冲溶液(pH 6)和6 mL蒸馏水的离心管中。在37 ℃的条件下，添加5 mL 的混合酶溶液(42 U/mL的α-淀粉酶和42 U/mL葡萄糖苷酶)，开始消化。分别在0，5，10，15，30，45，60，90，120 min等时间节点，取0.1 mL消化溶液并加入至0.9 mL 无水乙醇中以终止反应。将混合溶液在4 000 r/min 下离心10 min。以1.0 mg/mL的葡萄糖溶液作为标准溶液，用葡萄糖试剂盒(GOPOD试剂)测定消化液的吸光值，根据式(1)计算淀粉消化量随时间的变化。

(1)

式中：

SD——淀粉消化率，%；

Asample——样品吸光值；

Aglucose——葡萄糖标准品的吸光值；

10×210——21 mL的消化液中取0.1 mL并与0.9 mL 无水乙醇混合所涉及的换算系数；

162/180——淀粉葡萄糖单元与游离葡萄糖的质量比。

通过一阶动力学方程[式(2)]和LOS方法[the logarithm of the slop；式(3)]进一步转换分析米饭淀粉的消化特性。

Ct=C∞(1-e-k×t)，

(2)

(3)

式中：

Ct——t时刻米饭淀粉的水解量，%；

C∞——消化结束时淀粉消化量的估算值，%；

k——消化速率常数，min-1。

根据计算出的消化数据(ln[(Ci+2-Ci)/(ti+2-ti)])和除最后两点外的时间点[(ti+2+ti)/2]获得LOS图。根据ln(dCt/dt)与时间t数据的斜率变化反映消化速率不同的阶段，并根据一阶动力学方程的非线性曲线的拟合得到相应阶段的淀粉消化速率k。同时，按照Englyst方法[16]，计算快消化淀粉(rapidly digestible starch，RDS)、慢消化淀粉(slowly digestible starch，SDS)以及抗消化淀粉(resistant starch，RS)的含量。

1.3 数据分析处理

采用Excel 2010和SAS 9.2 进行数据统计分析，显著性分析水平为P<0.05，样品数据均表述为均值±标准偏差的形式。

2 结果与分析

2.1 微观形貌

图1为冷藏前后米饭断面形貌的SEM图片。由图1可知，新鲜米饭(0 d)中不存在大米原料的淀粉颗粒，在丁毅等[17]的研究中也有类似现象。样品呈三维多孔样的疏松质地，表明蒸煮过程中的水热效应充分破坏了淀粉及蛋白质自身的有序结构，促使淀粉糊化和蛋白质变性从而成三维凝胶网络状质地。在冷藏环境中存放1 d能够降低米饭质地中孔洞的尺寸，这是由于贮藏过程中米饭的淀粉与蛋白质分子逐渐从凝胶网络壁中溶出，致使凝胶网络结构部分塌陷，从而形成更为均一的微观质地。延长贮藏时间进一步弱化了米饭的多孔样质地，但程度相对较小。

图1 不同冷藏时间米饭的扫描电子显微镜图片

2.2 纳米结构

图2为不同冷藏时间米饭的小角X射线散射图谱。由图2(a)可知，蒸煮后的新鲜米饭未呈现天然淀粉层状结构的散射峰[18-19]，但在0.5 nm-1附近出现了强度较低的宽散射峰，这是由于蒸煮过程中的水热效应完全破坏了大米原料中的天然淀粉层状结构[20]，但新鲜米饭中仍存在少量由淀粉及蛋白质分子组装形成的有序结构，此类有序结构在纳米尺度上与无定型区域组装构成了非周期性的纳米结构[6]。

由图2(b)可知，冷藏1 d后米饭散射峰的位置向小角度偏移至0.3 nm-1处，且其强度明显增加，表明淀粉及蛋白质分子在贮藏过程中形成了更多的有序结构，这些结构结合无定型区域形成了尺寸更大且更为规整的非周期性结构[21]。同时，与新鲜米饭不同，冷藏后的米饭在3.9 nm-1也出现了明显的散射峰，这是由于淀粉的短程有序结构(双螺旋)与36个水分子借助氢键组装形成了B型淀粉晶体的六方晶胞[7]。延长冷藏时间适度增加了两个散射峰的强度，但并未明显改变散射峰的位置。由此可知，增加冷藏时间促使米饭形成了更为规整的结晶结构及非周期性结构，但变化程度较低且非周期性结构的尺寸未能进一步增加。

图2 不同冷藏时间米饭的小角X射线散射图谱及洛伦兹校正后的图谱

2.3 结晶结构

图3为不同冷藏时间米饭的X射线衍射图谱。新鲜米饭(0 d)未呈现大米原料的A型淀粉结晶结构衍射峰[22-23]，主要以非晶态的形式存在，仅在2θ衍射角度20°附近呈现十分微弱的衍射峰。因此，蒸煮过程中的水热效应大幅破坏了大米结构中的分子水平氢键网络，致使大米中原有的A型淀粉晶体消失，仅存在少量的热稳定性较高的V型淀粉晶体[8]。

图3 不同冷藏时间米饭的X射线衍射图谱

与新鲜米饭相比，冷藏1 d后米饭的V型结晶峰适度增强，并在衍射角度17°附近呈现微弱的衍射峰；由此可知，米饭中的淀粉链段在冷藏过程中重组装形成了B型淀粉晶体及V型淀粉晶体，这与前期研究中贮藏前后热加工淀粉结晶结构的变化规律相近[21]。然而，冷藏前后衍射图谱中B型晶体特征峰强度的变化幅度，明显低于小角散射图谱中B型晶体特征峰强度的变化。这与以下原因有关：同步辐射装置的小角散射图谱对结构的测试分辨率明显优于实验室装置的衍射图谱，而且淀粉分子具有十分典型的液晶特性[24]，其链段可在小角散射测试的水环境中转化为近晶态，从而使冷藏过程中淀粉结晶结构的变化易于被观测到。延长冷藏时间对米饭X射线衍射图谱特征的影响较小，这与小角X射线散射结果的变化规律相似，即进一步增加冷藏时间并未大幅度强化米饭的结晶结构。

2.4 短程有序结构

图4为冷藏不同时间米饭在800～1 200 cm-1范围内的红外光谱图，此范围的图谱与C—O及C—C伸缩振动有关，可用于表征淀粉构象及其与水分子的相互作用[25]。研究证实，淀粉红外谱图中1 022 cm-1附近的吸收强度与无定型态淀粉的相对含量呈正相关，995 cm-1附近的吸收强度与淀粉螺旋等短程有序结构的含量具有正相关关系[26-27]，相应红外吸收峰强度之比(R995 cm-1/1 022 cm-1)可用于表征淀粉类样品中短程有序结构的相对含量[28-29]。

经蒸煮后米饭的R995 cm-1/1 022 cm-1明显降低，即蒸煮过程的水热效应亦明显破坏了淀粉的螺旋内氢键作用，从而大幅减少米饭中淀粉短程有序结构的含量。课题组[6]近期研究也表明，蒸煮作用能够明显破坏糙米饭中淀粉的短程有序结构比例。较之新鲜米饭，贮藏1 d后米饭的R995 cm-1/1 022 cm-1明显升高(见图4)，即冷藏过程促进了淀粉分子重组装及短程有序结构的形成。进一步延长冷藏时间未能明显增加R995 cm-1/1 022 cm-1的数值，该结果与结晶结构及纳米尺度结构的变化规律相近，即增加冷藏时间主要是提升短程有序结构的规整程度但对其相对含量的影响较小。

2.5 消化特性

冷藏前后米饭的淀粉消化数据及其拟合曲线与LOS数据见图5，样品的消化特征参数如表1所示。新鲜米饭呈现消化速率明显不同的两个阶段(阶段一的消化速率k1高于阶段二的消化速率k2)。前期研究也证实提取后的淀粉在消化过程中也可能呈现单个阶段、两个阶段或3个阶段[30-33]。由表1可知，冷藏过程降低了米饭的消化速率k1，促使米饭中的部分快消化淀粉RDS转化为慢消化淀粉SDS，但未明显改变阶段二的消化速率k2及抗消化淀粉RS含量。冷藏1 d后米饭的慢消化淀粉含量达到40%左右。随着冷藏时间延长至2 d，米饭的消化速率k1与k2、快消化淀粉RDS含量等特征参数未发生明显改变，但其部分慢消化淀粉SDS转化为抗消化淀粉RS；进一步延长冷藏时间则未明显改变米饭的消化特征参数。由此可见，改变冷链米饭的贮藏时间能够调控冷链米饭的消化特性，1 d的短期冷藏能够明显降低米饭的消化速率k1，并显著提升其慢消化淀粉SDS含量。该现象的形成机制可基于冷链米饭多尺度结构的变化规律以及淀粉消化的理论进行探讨。

表1 不同冷藏时间米饭的消化特征参数†

图5 不同冷藏时间米饭的淀粉消化曲线、LOS曲线和非线性拟合曲线

米饭中淀粉的消化由α-淀粉酶、葡萄糖转苷酶等淀粉酶共同完成，酶分子在米饭结构中的迁移及酶—淀粉链段复合物的形成决定着淀粉的消化速率等特征[34-35]。上述结果显示，蒸煮过程中的水热效应明显破坏了大米中的蛋白体和淀粉的颗粒结构、层状结构、结晶结构和短程有序结构，淀粉及蛋白质分子从原有的多尺度结构中解组装，并结合水分子形成了多孔状的凝胶体系。与新鲜米饭相比，短期冷藏过程(1 d)能够降低米饭质地中微孔的尺寸，诱导分子重组装形成规整程度较低的短程有序结构、B+V型淀粉晶体及尺寸更大的非周期性纳米结构，促使米饭中形成了更多的慢消化态的多尺度结构域，减缓了结构中酶分子的迁移及酶分子—淀粉链复合物的形成，由此降低米饭的淀粉消化速率并增加其慢消化淀粉含量，但未明显促进抗消化淀粉的生成。然而，延长冷藏时间虽未显著改变米饭的微观形态和其他尺度结构的相对比例，但提升了米饭中非周期性纳米结构、淀粉晶体、短程有序结构等的规整程度，促使部分慢消化态结构区域转化为抗消化态结构域，抑制了消化酶分子活性位点对部分淀粉糖苷链段的吸附水解，导致慢消化淀粉含量降低和抗消化淀粉含量增加。

3 结论

试验从多尺度结构变化的角度系统研究了贮藏过程中冷链米饭中慢消化淀粉组分形成的机制。结果显示，时间为1 d的短期冷藏能够明显强化米饭中慢消化淀粉组分的形成。由结构分析数据可知，短期冷藏过程一方面促使米饭中的分子链段重组装形成短程有序结构(淀粉螺旋等)、长程淀粉晶体以及尺寸更大的非周期性纳米结构，另一方面降低了米饭中微米尺度上的孔隙尺寸，即微观质地的均一性提升。此类结构变化强化了米饭中慢消化态结构域的形成，促使部分快消化淀粉转化为慢消化淀粉并降低米饭中淀粉的消化速率，相应米饭的慢消化淀粉比例可达40%左右。与此不同，更长时间的冷藏过程则提升了米饭微观质地的均一性和短程有序结构、淀粉晶体以及非周期性纳米结构的规整程度，诱导部分慢消化态结构区域转化为抗消化态结构域。