辣椒素通过调节GRP78触发内质网应激对人急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的影响

张友弟，张 乐，江 明

0 引言

急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是成人最常见的白血病类型，也是最难治疗的血液系统恶性肿瘤之一(成人原发性AML的5年总生存率是20%～30%)[1-2]。AML的特征是分化障碍和不受控制的增殖[3]。AML的发病率逐年增长，尽管目前的疗法取得了进步，但是易复发仍然是临床上的关键问题。内质网(Endoplasmic reticulum,ER)是重要的细胞器，负责蛋白质的生物合成和折叠、细胞和钙的动态平衡。目前，ER被认为是最新发现的调节细胞凋亡的新焦点[4]。多种刺激可能会导致ER紊乱，包括钙代谢紊乱、氧化应激和蛋白质合成增强，这些统称为ER应激[5]。已有研究报道了ER的功能及其参与AML中的相关应激途径[6]。因此，靶向凋亡和内质网应激可能对开发有效的白血病治疗方法有启示作用。辣椒素(Capsaicin,Cap)是辣椒属植物辣椒中主要的刺激性成分，该化合物主要存在于辣椒和辣椒的白髓和膜中[7]。研究表明，辣椒素具有调节心血管系统、镇痛止痒、抗肿瘤、抗炎、抗疲劳、清除自由基等作用[8]。本研究观察辣椒素对HL-60细胞的凋亡是否有促进作用，其作用机制是否与GRP78触发内质网应激有关，并进一步探讨其作用机制，为临床治疗AML提供新的理论依据。

1 实验材料

1.1 细胞 人急性髓系白血病细胞系HL-60购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2 主要试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司，辣椒素和兔抗人GRP78抗体购自美国Sigma公司，CCK-8试剂盒、RIPA裂解液和BCA试剂盒购自美国promega公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自瑞士Roche公司，Salubrinal(ER应激抑制剂)购自美国MCE公司，LipofectamineTM 3000购自美国Invitrogen公司，ShGRP78和shScramble购自上海吉玛制药技术有限公司，鼠抗人GAPDH抗体购自美国Biovision公司，山羊抗兔IgG抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要仪器 酶标仪购自美国Bio-Tek公司，倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，流式细胞仪购自美国Beckman-Coulter公司，Gel Doc XR+凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养 HL-60细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养，2 d更换一次培养基，以保证细胞所需的营养成分。当传代3次后，可以进行后续的实验。

2.2 CCK-8检测辣椒素毒性 HL-60细胞以3×103个/孔种到96孔板中，每孔100 μl。细胞分为：0 μmol/L辣椒素组[Cap(0)组]、10 μmol/L辣椒素组[Cap(10)组]、20 μmol/L辣椒素组[Cap(20)组]、40 μmol/L辣椒素组[Cap(40)组]、60 μmol/L辣椒素组[Cap(60)组]和80 μmol/L辣椒素组[Cap(80)组]，每组3个复孔。置于37 ℃、5% CO2条件下孵育24 h。将10 μl CCK-8试剂加到每个孔中。2 h后使用酶标仪在450 nm处测量每孔细胞的OD值，计算细胞活力。

2.3 Wright-Giemsa染色 将HL-60细胞以5×104个/孔密度接种于12孔培养板，加入相应浓度的辣椒素孵育24 h后，更换为无血清培养基。HL-60细胞用Wright试剂处理并培养24 h，PBS冲洗2次。HL-60细胞经固定后，用Giemsa试剂染色。最后，在倒置相差显微镜下观察细胞并拍照。

2.4 Salubrinal预处理HL-60细胞 以1×105个/孔接种于24孔板，用Salubrinal(15 μmol)预处理2 h后，再用辣椒素(60 μmol/L)处理24 h。实验结束后，收集细胞进行后续实验。

2.5 细胞转染 按照LipofectamineTM3000转染试剂说明书将50 ng的shGRP78和shScramble分别转入HL-60细胞中。在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养6 h后，更换新鲜的培养基继续培养。48 h后，再用辣椒素(60 μmol/L)处理24 h。实验结束，收集细胞进行后续实验。

2.6 细胞流式术 各组细胞用冰PBS冲洗1次，在加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI后再用300 μl缓冲液重悬，将细胞在避光的室温下孵育10 min。使用流式细胞仪检测细胞凋亡，并使用CellQuest软件分析数据。

2.7 Western blot RIPA裂解液提取HL-60细胞的总蛋白，用BCA法测定总蛋白含量。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂奶封闭1 h后，将PVDF膜与以下抗体在4 ℃孵育过夜：兔抗人GRP78抗体(1∶1 000)、兔抗人GAPDH抗体(1∶2 000)。随后，将PVDF膜用TBST洗涤3次，持续5 min，并与山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)孵育1 h，用TBST洗涤3次，持续5 min。最后显影曝光，用Image-Pro Plus图像分析系统对蛋白条带的灰度值进行分析。

3 结果

3.1 辣椒素的浓度筛选 CCK-8结果表明(图1)，用不同浓度的辣椒素(0、10、20、40、60和80 μmol/L)处理HL-60细胞24 h后，HL-60细胞的细胞活力受到辣椒素浓度的影响。当辣椒素浓度为40、60、80 μmol/L时，HL-60细胞的细胞活力在50%左右(P<0.001)，因此，后续实验辣椒素的浓度选择40、60、80 μmol/L。

图1 CCK-8用于检测不同浓度的辣椒素对HL-60细胞活力的影响

3.2 辣椒素对HL-60细胞形态的影响 Wright-Giemsa染色结果表明(图2)，经不同浓度辣椒素处理后的HL-60细胞出现：染色质浓集，呈半月状或指环状，线粒体肿胀、空泡样变、内质网扩张等变化；随着辣椒素浓度的增加，HL-60细胞的数目逐渐减少。

图2 Wright-Giemsa染色观察不同浓度的辣椒素对HL-60细胞形态的影响

3.3 辣椒素对HL-60细胞凋亡的影响 细胞流式术结果表明(图3)，经不同浓度辣椒素处理后的HL-60细胞，其细胞凋亡率随着辣椒素浓度的增加而增加(P<0.001)。提示辣椒素显著诱导了HL-60细胞的凋亡。

图3 Annexin V-FITC/PI双重染色方法用于检测不同浓度的辣椒素对HL-60细胞凋亡的影响

3.4 辣椒素对内质网应激信号传导的影响 Western blot结果表明，GRP78(内质网应激反应的主要标志分子之一)蛋白的表达量随着辣椒素浓度的升高而不断增加(P<0.05，P<0.001，P<0.001。图4A)。使用Salubrinal(ER应激抑制剂)预处理HL-60细胞，发现通过Salubrinal预处理可以明显减少GRP78蛋白的表达(P<0.01。图4B)。

图4 Western blot检测辣椒素对GRP78蛋白表达的影响

3.5 辣椒素通过内质网应激信号传导对HL-60细胞凋亡的影响 流式细胞术结果表明(图5)，Salubrinal预处理后，HL-60细胞凋亡率与辣椒素诱导HL-60细胞凋亡率下降(P<0.05)，提示辣椒素诱导的HL-60细胞凋亡依赖于ER应激。

图5 辣椒素通过内质网应激信号传导对HL-60细胞凋亡的影响

3.6 辣椒素对CRP78蛋白表达的影响 Western blot结果表明(图6)，与未经任何处理的细胞组相比，辣椒素显著增加GRP78蛋白表达(P<0.001)；辣椒素增加的GRP78蛋白表达在转染shGRP78的HL-60细胞中下调(P<0.001)。

图6 辣椒素对CRP78蛋白表达的影响

3.7 辣椒素通过GRP78诱导内质网应激对HL-60细胞凋亡的影响 与未经任何处理的细胞组相比，辣椒素显著增加HL-60细胞凋亡(P<0.001)；在shGRP78转染的HL-60细胞中，由辣椒素触发的显著凋亡也被消除(P<0.01)。见图7。

图7 辣椒素对内质网应激通过GRP78诱导的HL-60细胞凋亡的影响

4 讨论

AML是起源于髓细胞前体的造血系统恶性肿瘤，是成年人中最常见的急性白血病[9]。AML是一种分子异质性疾病，通常与不良预后相关。根据细胞遗传学和分子异常，将AML患者分为经过风险调整的化疗的不同风险类别[10]。由于AML的难治愈性或复发性，60岁以下的患者很少被治愈。对于60岁以上的患者，预后更差[11-12],因此,需要新的治疗方法。

辣椒素是辣椒中的主要活性成分，具有镇痛止痒、抗肿瘤、抗炎、抗疲劳、清除自由基等作用[13]，例如，辣椒素通过抑制Wnt/β-catenin途径抑制前列腺癌干细胞的活性[14]。研究显示，辣椒素能诱导人黑素瘤细胞凋亡和自噬[15]。本研究发现，辣椒素可使HL-60细胞出现染色质浓集，呈半月状或指环状等变化，且随着辣椒素浓度的增加，HL-60细胞的数目逐渐减少；经不同浓度辣椒素处理后的HL-60细胞，其细胞凋亡率逐渐增加。

内质网应激是多种细胞生理和病理事件的关键调节剂，包括对抗肿瘤药物起反应的细胞凋亡信号传导途径。内质网应激导致未折叠或错误折叠的蛋白质以及3个内质网跨膜换能器的积累[16-17]。同时，内质网应激可促进Bax、Bcl-2的重要促凋亡家族成员。Bax对于调节不同刺激诱导的内在凋亡通路是必需的[18]。越来越多的研究表明，内质网应激是白血病进展的重要机制，并参与细胞凋亡的诱导[19]。本研究显示，辣椒素显著诱导了HL-60细胞的ER应激，使GRP78(内质网应激反应的主要标志分子之一)蛋白表达上调。应用Salubrinal(ER应激抑制剂)预处理HL-60细胞后，结果表明，通过Salubrinal预处理可以明显减少GRP78蛋白的表达，降低HL-60细胞的凋亡率。

GRP78是细胞内质网应激的主要标志分子，在调节内质网应激中起着至关重要的作用[20]，其在维持肿瘤微环境稳定，增强肿瘤细胞存活性、侵袭性和转移性，抵抗抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡等有重要作用[21]。本实验中，沉默GRP78使辣椒素增加的GRP78蛋白表达下调；在shGRP78转染的HL-60细胞中，由辣椒素触发的凋亡也被消除。

综上所述，辣椒素显著降低HL-60细胞的细胞活力，促进其凋亡。辣椒素触发的细胞凋亡可能取决于内质网应激，与调节GRP78的表达有关。因此，可将辣椒素用作治疗AML的可选药物，为临床上治疗AML提供新的理论依据。