基于化学模式识别技术的不同干姜炮制品质量比较△

高伟城，王小平，沈晓华，何丽珊，柯庆辉

漳州卫生职业学院，福建 漳州 363000

干姜为姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根茎，能温中散寒、回阳通脉、温肺化饮[1]，始载于《神农本草经》，列为中品。《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版收载炮制方法有趁鲜切片晒干或低温干燥(干姜片)、炒炭(姜炭)、砂烫(炮姜)[1]。历代炮制方法还有炒干姜(炒黄、土炒、麸炒)、蜜干姜、盐干姜3种方法，其中土炒干姜首载于《类编朱氏集验方》[2]，收载于《福建省中药饮片炮制规范》1998年版[3]。

不同炮制方法对干姜的化学成分产生不同影响，临床疗效大有不同，如炮姜温中散寒、温经止血，姜炭温经化瘀止血，土炒干姜祛寒止泻[3]。因此，很有必要对干姜的不同炮制品质量进行比较。本实验采用化学模式识别技术对生品干姜、清炒干姜、土炒干姜、炮姜及姜炭等不同炮制品中所含化学成分进行差异分析比较，可为其质量评价、临床安全用药的深入研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪；Mettler-Toledo HS153型电子分析天平、Mettler-Toledo XSE205DU型电子分析天平；KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FST-Ⅲ-10 型精密型超纯水机(上海富诗特环保科技有限公司)；H1650R型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2 试药

干姜生品购自江西药都堂中药饮片有限公司，产地：四川，批号：20180801，经漳州卫生职业学院中药教研室王小平教授鉴定为姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根茎。不同干姜炮制品样品信息见表1。

表1 不同干姜炮制品样品信息

对照品6-姜酚(批号：MUST-19080704)、8-姜酚(批号：MUST-19032804)、10-姜酚(批号：MUST-19063004)、6-姜烯酚(批号：MUST-19032101)均购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均大于99%；乙腈为色谱纯；甲醇、磷酸试剂为分析纯；水为自制超纯水。

1.3 炮制样品制备

见表2。

表2 不同干姜炮制品的炮制方法及制备依据

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(B)-0.1%磷酸水(A)，梯度洗脱(0～6 min，5%～15%B；6～10 min，15%～20%B；10～15 min，20%～25%B；15～18 min，25%～28%B；18～20 min，28%～30%B；20～23 min，30%～38%B；23～35 min，38%～45%B；35～40 min，45%～60%B；40～43 min，60%～65%B；43～50 min，65%～70%B；50～75 min，70%～80%B；75～85 min，80%～90%B；85～90 min，90%～93%B；90～96 min，93%～95%B)；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量10 μL；柱温：30 ℃。理论板数以6-姜酚计，不低于4000。

2.2 溶液的配制

2.2.1混合对照品溶液的制备 分别精密称取适量的6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚对照品，置25 mL量瓶中，加75%甲醇定容至刻度，制成分别含6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚53.50、22.50、56.75、69.25 μg·mL-1的混合对照品溶液，备用。

2.2.2供试品溶液的制备 分别取不同干姜炮制品适量，粉碎过50目筛，各称取约粉末0.5 g，置具塞锥形瓶，精密加入75%甲醇20 mL，密塞，称质量，

超声提取40 min(频率：40 kHz，功率：250 W)，取出，放冷，再称质量，用75%甲醇补足减失的质量，提取液13 000 r·min-1(离心半径为63 mm)离心10 min，滤过，得续滤液，摇匀，备用。

2.3 样品测定

分别吸取混合对照品溶液与不同干姜炮制品(S1-1、S2-1、S3-1、S4-1、S5-1)的供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录97 min色谱图，结果见图1。

注：R.参照物；S1-1.生品干姜；S2-1.清炒干姜；S3-1.土炒干姜；S4-1.炮姜；S5-1.姜炭；1.6-姜酚；2.8-姜酚；3.6-姜烯酚；4.10-姜酚。图1 干姜不同炮制品HPLC图

2.4 方法学考察

2.4.1精密度试验 取生品干姜供试品(S1-1)溶液，按照2.1项下色谱条件连续进样6次测定，记录色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2004A)进行图谱分析，结果各样品相似度均大于0.99。各主要色谱峰的相对峰面积值及相对保留时间的RSD分别为0.15%～0.85%、0.22%～0.46%，表明仪器精密度良好。

(2)八达岭野生动物园安装监控摄像头共106个，东北虎园东北门、西北门各有1个监控摄像头，运行状况良好。由此可见，假若动物园工作人员随时查看监控录像，应该可以及时发现危险的发生并且采取措施。

2.4.2重复性试验 取生品干姜(S1-2)共6份，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件分别进样，记录色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2004A)进行图谱分析，结果各样品相似度均大于0.98。各主要色谱峰的相对峰面积值及相对保留时间的RSD分别在0.31%～0.84%、0.23%～0.36%，表明该方法重复性良好。

2.4.3稳定性试验 取生品干姜(S1-3)供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、24 h进样，记录色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2004A)进行图谱分析，结果各样品相似度均大于0.98。各主要色谱峰的相对峰面积值及相对保留时间的RSD分别在0.19%～0.65%、0.08%～0.29%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 不同干姜炮制品HPLC图谱的建立

2.5.1不同干姜炮制品HPLC图谱采集 按2.2.2项下方法分别制备生品干姜、清炒干姜、土炒干姜、炮姜及姜炭的各5批供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图，分别采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2004A)进行图谱分析，得不同干姜炮制品叠加HPLC图谱，见图2～6。

图2 5批生品干姜HPLC图

图3 5批清炒干姜HPLC图

图4 5批土炒干姜HPLC图

图5 5批炮姜HPLC图

图6 5批姜炭HPLC图

2.5.2不同干姜炮制品图谱的直观比较 将不同干姜炮制品的图谱与混合对照品图谱进行直观比较分析。不同干姜炮制品均含有6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚4个成分，且含量占比高，与文献报道一致[6]。6-姜酚、8-姜酚及10-姜酚色谱峰的峰面积高低顺序为生品干姜、土炒干姜、清炒干姜、姜炭、炮姜；6-姜烯酚色谱峰面积高低顺序为生品干姜、炮姜、姜炭、土炒干姜、清炒干姜。生品干姜、清炒干姜、土炒干姜与炮姜、姜炭在1、2、3、4峰有明显的区别，提示在炮制过程中有明显的新成分生成；其中峰1是土炒干姜、姜炭、炮姜共有，峰3是炮姜、姜炭共有，峰2、4则炮姜、姜炭峰面积明显高于生品干姜、清炒干姜、土炒干姜。不同炮制方法对干姜的内在化学成分的组成变化及量有影响。

2.5.3相似度分析 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2004A)，对不同干姜炮制品进行相似度分析。炮姜与生品干姜相比较，相似度有显著差异、其次是姜炭、土炒干姜，见表3。其中，炮姜、姜炭成分组成有变化；清炒干姜、土炒干姜成分组成基本一致；不同炮制方法成分的含量均有所区别，见图7。

表3 不同干姜炮制品相似度分析

注：1.tR=7.904 min；2.tR=11.36 min；3.tR=16.302 min；4.tR=25.629 min。图7 不同干姜炮制品叠加图谱

2.6 系统聚类分析(HCA)

采用SPSS 22.0分析软件，以组之间链接及平方Euclidean距离方法，对25 批样品进行HCA[7]。结果不同干姜炮制品基本可分为4大类(图8)，S2(S2-1～S2-5)、S3(S3-1～S3-5)聚为第一类，S1(S1-1～S1-5)聚为第二类，S4(S4-1～S4-5)聚为第三类，S5(S5-1～S5-5)聚为第四类。

图8 不同干姜炮制品聚类谱系

2.7 偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)

将25 批样品共有色谱峰峰面积信息，导入SIMCA-P 14.1软件中进行PLS-DA见图9。结果发现，25批样品基本可分为4 组，S1(S1-1～S1-5)为第一类、S2(S2-1～S2-5)、S3(S3-1～S3-5)为第二类，S4(S4-1～S4-5)为第三类，S5(S5-1～S5-5)为第四类。与HCA结果一致。

图9 不同干姜炮制品HCA图

2.8 PLS-DA

图10 不同干姜炮制品差异性变量VIP图

2.9 6-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的含量测定

2.9.1色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)溶液，梯度洗脱(0～15 min，38%～68%A；15～30 min，68%～70%A；30～40 min，70%～95%A；40～60 min，95%～92%A)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃。HPLC图见图11。

注：A.混合对照品；B.生品干姜；C.清炒干姜；D.土炒干姜；E.炮姜；F.姜炭；1.6-姜酚；2.6-姜烯酚；3.10-姜酚。图11 对照品及不同干姜炮制品的HPLC图

2.9.2混合对照品溶液的制备 精密称取适量的6-姜酚、6-姜烯酚及10-姜酚对照品，置10 mL量瓶中，75%甲醇定容至刻度，摇匀，制成分别含6-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚107.0、113.5、138.5 μg·mL-1的混合对照品储备溶液，备用。

2.9.3线性关系考察 分别精密吸混合对照品溶液1、2、3、4、5、10 mL置10 mL量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，按2.9.1项下色谱条件进行测定。以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，结果分别为6-姜酚：Y=534.85X-1.289 4，r=0.999 9；6-姜烯酚：Y=2 261.2X+37.021，r=0.999 7；10-姜酚：Y=477.37X+ 67.249，r=0.999 1。可知6-姜酚在0.214～2.14 μg、6-姜烯酚在0.227～2.27 μg、10-姜酚在0.277～2.77 μg进样量与峰面积线性关系良好。

2.9.4精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，按照2.9.1项下色谱条件，连续进样6次测定，记录色谱图，测得各对照品的峰面积RSD为0.15%～0.87%，表明仪器精密度良好。

2.9.5稳定性试验 取同一份供试品溶液(S1-3)，按照2.9.1项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、24 h测定，记录色谱图，测得各对照品的峰面积RSD为0.23%～1.07%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9.6重复性试验 取同一份样品(S1-1)5份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.9.1项下色谱条件，测定，记录色谱图，测得各样品的峰面积RSD为1.46%～1.92%，表明方法重复性良好。

2.9.7加样回收率试验 精密称取9份已知量的样品，每3份为1组，分别加入对照品溶液为各样品中成分量的80%、100%、120%，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.9.1项下色谱条件测定，记录色谱图，测得各样品的加样回收率为98.46%～101.12%，RSD为0.21%～1.76%。

2.9.8不同干姜炮制品含量测定 分别取25批不同干姜炮制品样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.9.1项下色谱条件测定，结果见表4。

表4 不同干姜炮制品中6-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚含量测定结果 mg·g-1

3 讨论

3.1 测定波长、流动相和提取条件的选择

在借鉴前人的研究结果基础上[8-9]，采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，结果发现，在280 nm基线稳定、色谱峰较多。比较不同时间和甲醇体积分数下，不同干姜炮制品的超声提取效果，结果发现，75%甲醇提取40 min，分离效果好，色谱峰较多。分别考察乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸水，发现乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱，色谱峰信息较丰富、峰形对称、分离度好，可为不同干姜炮制品的质量控制提供一定参考。

3.2 不同炮制方法对干姜的化学成分的影响

通过共有峰图谱、HCA及PCA发现，不同炮制方法对干姜的化学成分的组成变化有影响，其中炮姜、姜炭变化较显著，表现在新成分的产生及峰面积的大小，这可能与加热时间延长及温度的升高有关。

3.3 干姜不同炮制品的临床应用的内在依据

金元医家李杲云：“干姜，生辛炮苦，阳也，生用逐寒邪而发表，炮则除胃冷而守中”[10]，表明生品干姜与其炮制品功效有明显差异，临床应用有所区别。本实验研究表明，炮制前后，土炒干姜、炮姜及姜炭有新色谱峰出现，这可能是干姜不同炮制品的临床应用不同的内在依据。

3.4 干姜不同炮制品增加指标性成分质量控制

研究表明，姜酚具有舒张血管并表现良好的抑制血小板聚集作用[11]。本研究表明，炮姜、姜炭的姜酚含量明显低于生品干姜、清炒干姜、土炒干姜，与其长于止血相吻合。且不同干姜炮制品化学组成成分的存在差异，而成分差异主要标记物为已确定的6-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚3个药效成分，对其临床疗效产生不同影响。故应增加不同干姜炮制品中6-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚等成分的含量控制，进一步提高其安全性、有效性。