葡萄柚果醋液态深层发酵特性研究

曹雪丹 方修贵 赵 凯

（浙江省柑橘研究所 台州 318026）

葡萄柚(Citrus paradisiMacf.)是芸香科柑橘属植物，为世界柑橘四大类群(甜橙类、宽皮柑橘类、柠檬来檬类、葡萄柚和柚类)之一[1]。其果实风味独特，果实多汁，营养丰富，深受消费者喜爱。经过多年的引种栽培，已逐渐在我国形成了一些具有一定种植规模的主栽品种。据分析，每100 g全果含水分89.64 g、蛋白质 0.89 g、脂肪 0.1 g、碳水化合物 9.5 g；钙18mg、磷17mg、铁 0.1mg；VB10.06mg、VB20.03mg、VC4 0mg；每升果汁含柚皮苷528～743 mg，可以形成VP，具有清热退火的功效[2]。而且，葡萄柚汁有助于保持肝脏移植术后患者排斥抑制剂FK506的谷值浓度，提高其生物利用度[3]。对中国主栽的 9个葡萄柚品种的酚类物质组成及其抗氧化活性研究发现，葡萄柚不仅多酚含量极其丰富，而且抗氧化能力也高[4]，是具有良好开发前景的天然抗氧化剂和保健食品原料。

果醋是以水果或水果加工下脚料为主要原料，经微生物酒精发酵、醋酸发酵酿制而成的一种营养丰富、风味优良且具有抑菌，抗氧化，缓解疲劳，预防饮食型肥胖和高脂血症等生理功能的酸性调味品[5]。我国传统酿醋多采用混合菌缓慢发酵的固态工艺，生产周期长达 3个月，劳动强度大，生产成本高。采用液态发酵法生产果醋具有易操作管理，规模化标准化生产，有利于缩短生产周期[6]。近年来，柑橘类果醋的研究报道大多针对菌种的筛选和发酵工艺的优化等方面。如：刘青娥等[7]以自然酸发酵的柑橘醋液为菌源，筛选出41株醋酸菌，其中 1株耐温性能和耐酒精能力均优于对照菌株沪酿 1.01；程世春[8]从水果中分离得到 1株高产醋酸菌株可用于常规液体发酵法酿造柑橘果醋；王彦安等[9]采用Box-Behnken设计进行柑橘果醋的酒精发酵和醋酸发酵工艺的响应面优化，得出酒精发酵参数为：初始糖度为16%、接种量为5%、初始pH为 3.5，醋酸发酵参数为:接种量为 8.52%、初始酒精度为 6.02%、发酵pH为3.3，该工艺下醋酸产量53.11g/L；曹雪丹等[10]对椪柑果醋液态发酵工艺进行了优化，并经GC-MS分析鉴定出了66种挥发性物质。

但是，目前对液态深层法发酵葡萄柚果醋的研究并不多见。本试验以沪酿 1.01醋酸杆菌为研究对象，以葡萄柚为研究试材，对液态深层发酵工艺及发酵特性进行研究，以期为葡萄柚及柑橘类果醋的工业化发酵提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

葡萄柚采自浙江省柑橘研究所山地试验站。高活性酿酒干酵母（RV171）：安琪酵母股份有限公司。醋酸菌（沪酿 1.01）：上海迪发酿造生物制品有限公司。白砂糖，偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）等均为食品级；氢氧化钠（NaOH）等常规试剂均为国产分析纯；聚醚砜滤膜（孔径 0.45μm）：美国密理博公司；果胶酶（活力10万u/ml，液体型）：宁夏和氏璧生物技术有限公司；醋酸菌分离培养基：青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器

PAL- 3手持式数字折射仪（日本ATAGO公司）；MJ-176NR榨汁/搅拌机（日本松下电器产业株式会社）；SW-CJ- 1FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；ZHWY-2102 C恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）； 5 L试验型自吸发酵罐（南京汇科生物工程设备有限公司）；雷磁JPB-607 A便携式溶解氧测定仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）；FlveGo F2便携式pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；Heal Force HF-151二氧化碳恒温培养箱（上海力申科学仪器有限公司）；XK97-A菌落计数器（杭州齐威仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程。挑选大小均匀、成熟度一致的新鲜葡萄柚为原料→用自来水流水冲洗果皮后自然晾干→手工剥皮、去籽→将果肉投入榨汁机中破碎取汁→收集果汁并添加 0.5‰果胶酶，常温（20℃）酶解→添加焦亚硫酸钠30～50mg/L并经100目尼龙纱网粗滤→添加活化后的酵母菌200～400mg/L →常温（20℃）酒精发酵 5～ 7 d→低温（ 8℃）静置48 h以上→吸取上清液移入液态发酵罐，测得酒精含量为 4%，添加酵母提取物5‰、葡萄糖 8‰，升温至36℃后接种沪酿1.01醋酸菌 4‰→调整发酵罐转子转速≥1000rpm，醋酸发酵→澄清→过滤→灌装→灭菌→成品。

1.3.2 醋酸菌分离计数。平板涂布法。称取醋酸菌分离培养基55.0 g，用1000ml蒸馏水加热溶解，分装并于116℃高压灭菌20min，冷却至50℃再加入 3%无水乙醇，摇匀后倒入培养皿，待用。准确吸取发酵液 1ml，迅速在无菌环境下按梯度稀释至109倍，每个梯度吸取 0.1ml接种至培养基上，并用涂布棒快速涂匀，30℃恒温培养箱中倒置培养48 h，培养结束后观察培养基颜色的变化和菌落形态，记数。

1.3.3 溶解氧测定。参考HJ 506-2009[11]采用电化学探头方法。

1.3.4 pH。采用pH计直接测定。

1.3.5 滴定酸。采用酸碱测定法测定。

2 结果与分析

由图 1可以看出，沪酿 1.01醋酸菌在葡萄柚果醋发酵过程中的活菌数变化具有先升高后降低的趋势。在发酵初始阶段，醋酸菌计数为 5.6 2 log CFU/mL，此后的48 h内进入快速增殖阶段，醋酸菌数量最大值达10.7 3log CFU/mL，之后维持在 9.0 log CFU/mL水平并有所下降。通常情况下培养 1 d后为醋酸菌的增殖过程，此时酒精消耗量很小，产酸量并不明显。培养 2 d后，醋酸菌进入代谢旺盛阶段，醋酸菌数量增加不再明显，此时产酸速度加快。一般培养 4～ 5 d即可达到产酸量的最大值。

图1 葡萄柚醋发酵过程中醋酸菌计数的变化

由图 2可以看出，在葡萄柚果醋发酵过程中溶解氧含量的变化呈下降趋势。在发酵24 h内，发酵液中溶解氧含量呈急速下降的趋势，由 8.0mg/L下降至 0.5mg/L，之后一直维持在较低水平。这可能是因为沪酿 1.01醋酸菌在葡萄柚果醋发酵初始阶段快速增殖，需要消耗大量氧气。至整个发酵阶段，醋酸菌对氧气的需求量一直较高，这可能是测得发酵液溶解氧含量较低的原因之一。

图2 葡萄柚醋发酵过程中溶解氧量的变化

由图 3可以看出，在葡萄柚果醋发酵过程中pH值呈降低趋势。相比醋酸菌种子培养液（由酵母提取物 1.0%、葡萄糖 4.0%、酒精 4.0%等配制）的pH值≥ 6.5而言，葡萄柚汁的pH值较低，发酵初始阶段仅为 4.0左右，可能会对醋酸菌的增殖速度和产酸能力造成影响。但是最终pH值降低至 3.6左右，接近一般食醋pH值 3.2～3.5水平。

图3 葡萄柚醋发酵过程中pH值的变化

由图 4可以看出，葡萄柚果醋发酵过程中滴定算含量呈增加的趋势。由发酵初始阶段滴定酸含量 0.5%至发酵96 h后达 2.4%。按照初始酒精度 4%计算，理论最大产酸量也为 4%。但是考虑深层发酵罐搅拌、通气过程中造成约30%左右的酒精逃逸损失，实际的理论产酸量约为2.8%，则产酸率达到85.71%。提高发酵初始酒精度对产酸率的影响尚待进一步研究。

图4 葡萄柚醋发酵过程中滴定酸含量的变化

3 结论

醋酸发酵是果醋生产的重要阶段，发酵方法的选择决定了果醋的发酵风味、发酵效率，而醋酸菌菌种对果醋品质的影响较大。近年来，关于柑橘果醋发酵菌种的筛选研究时有报道，但是能否适应液态深层发酵工艺尚不明确。本实验结果表明，沪酿 1.01醋酸菌可用于液态深层发酵法酿制葡萄柚果醋，48 h内为该醋酸菌的快速增殖期，发酵96 hpH值为 3.6，可滴定酸含量 2.4%。但还需进行果醋发酵工艺条件的优化，为液态深层发酵柑橘类果醋的应用研究提供一定的理论参考，以促进柑橘果醋的工业化生产。