土壤有效磷测定中二硝基酚指示剂替代研究

2021-07-06姚周麟吴韶辉应晶琪王达萍

浙江柑橘 2021年2期

姚周麟吴韶辉应晶琪王达萍林媚

（浙江省柑橘研究所 318026）

磷元素是农作物的生长和发育过程中必需的大量营养元素之一。橘园土壤有效磷是土壤养分的一个重要指标及磷肥施用量的参考指标，其可用于更好地指导柑橘果园的生产管理。目前土壤有效磷测定方法有全波长酶标仪法[1]，吸收光谱测量法[2]，高光谱法[3]，Olsen法[4]等。本实验室主要采用行业标准（NY/T1121.7-2014）吸收光谱法，该法中将土壤分为酸性土壤（pH＜ 6.5）和中性、碱性土壤（pH≥ 6.5）并采用不同试剂进行提取。柑橘园土壤pH分级标准为pH＜ 4.5（强酸性），4.5～ 5.5（酸性）， 5.5～ 6.5（弱酸性）， 6.5～7.5（弱酸至弱碱性），＞ 7.5（碱性） 5 级。其中pH 4.5～ 5.5和 6.5～ 7.5基本适宜柑橘生长，pH 5.5～ 6.5的弱酸性土较适宜柑橘生长[5]。研究表明，大多数的柑橘产区土壤为偏酸性，如云南玉溪[5]、湖北夷陵区[6]、湖北丹江口市[7]、三峡库区[8]、重庆市[9]、广西[10]等[11]，适用此法来进行测定。

在对酸性土壤有效磷的测定中，需要用到二硝基酚指示剂来调节酸碱度，以获得更好的显色效果。而二硝基酚（ 2, 4-二硝基酚或 2, 6-二硝基酚，如图 1）有较强的健康危害，致突变性、DNA抑制和生殖毒性，成人口服致死量约1 g，可通过吸入、食入、经皮肤等途径吸收。同时，二硝基酚又具有危险特性，遇火种、高温、摩擦、震动或接触碱性物质、氧化剂时均易引起爆炸，已被列入公安部确定、公布的《易制爆危险化学品名录》，很多厂家已禁售，购买非常困难。因此，有必要开展该检测法中二硝基酚的替代指示剂研究。

图1 2,4-二硝基酚和 2,6-二硝基酚结构图

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为浙江省柑橘园 0～30 cm土壤，过 2 mm筛孔风干。

1.2 仪器设备

电子天平（AR1502CN），台式恒温振荡器（THZ-D），紫外可见分光光度计（UV-2600）,数显恒温水浴锅（GHH- 6）等。

1.3 试剂配置

1.3.1 二硝基酚指示剂：称取 0.20 g 2, 4-二硝基酚或 2, 6-二硝基酚溶于100mL水中。甲基橙指示剂：称 0.10 g甲基橙溶于100mL脱盐水中，摇均即可。

1.3.2 磷标准溶液（ 5 mg/L）和钼锑抗显色剂参照NY/T 1121.7-2014中的方法。

1.4 方法

浸提：称取 5.00 g试样于200mL塑料瓶中，加入氟化铵-盐酸浸提剂50.00mL，振荡30min（180±20r/min），立即用无磷滤纸干过滤。

二硝基酚为指示剂测定方法：吸取滤液10.00mL于50mL容量瓶，加入10mL硼酸溶液，摇匀，加水至30mL左右，再加入 2滴二硝基酚指示剂，用硫酸溶液和氨水溶液调节至溶液刚显微黄色，加入 5.00mL钼锑抗显色剂，用水定容至50mL，在30℃恒温水浴中静置30min，用 1cm光径比色皿在波长700nm处，以标准溶液的零点调零后进行比色测定。同时进行空白溶液的测定。

替代指示剂测定方法：其余条件不变，用替代指示剂来调节试液酸碱度。

标准曲线：分别吸取 5mg/L磷标准溶液0.00mL、 1.00mL、 2.00mL、 4.00mL、 6.00mL、8.00mL、10.00mL于50mL容量瓶中，分别按要求加入浸提剂，硼酸溶液，指示剂，显色剂，并用水定容至刻度，充分摇匀，即得含磷0.00mg/L、 0.10mg/L、 0.20mg/L、 0.40mg/L、0.60mg/L、 0.80mg/L、 1.00mg/L 的磷标准系列溶液。比色参照上述样品测定方法。

2 结果分析

2.1 替代指示剂的选择

NY/T1121.7-2014标准中，以 2, 4-二硝基酚或 2, 6-二硝基酚用作酸碱指示剂，其变色范围是pH为 2.4（无色）～ 4.0（黄色）。在替代指示剂的选择上，尽量要靠近这个变色范围。根据酚酞、石蕊、甲基红、溴甲酚绿等常用指示剂的变色范围，发现甲基橙指示剂较符合条件。甲基橙，又名 4-｛[ 4-(二甲氨基)苯基]偶氮基｝苯磺酸钠盐（图 2），其作为酸碱指示剂，变色范围是pH为 3.1（红）～4.4（黄）。

图2 甲基橙结构图

2.2 磷标准曲线

采用不同的指示剂调节酸碱，均有明显的突变点，以甲基橙作为指示剂的试液，突变点为橙红色至橙黄色。从制作的磷标准曲线（图3， 4）可以看出，指示剂对吸光度的斜率影响不大，在磷浓度 0.00～ 1.00mg/L范围内均具有良好的线性，R能达到0.9999。在实际显色中，以二硝基酚为指示剂调酸碱后，最终显色为蓝色，磷浓度越高，蓝色越深（图5）；而采用甲基橙作为指示剂，显色会偏红，磷浓度越低，偏红越明显，磷浓度越高，显色逐渐趋于蓝色（图 6）。

图3 以二硝基酚为指示剂调酸碱后的磷标准曲线

图4 以甲基橙为指示剂调酸碱后的磷标准曲线

图5 以二硝基酚为指示剂的标准溶液显色效果

图6 以甲基橙为指示剂的标准溶液显色效果

2.3 实际样品及质控样测定

实验选择了12个酸性土样，及一个有证标准物质GBW07458（pH为 6.14± 0.07），对有效磷含量值进行测定。每个试样做三个平行样，测定数据以平均值表示，实验结果如表 1。以二硝基酚为指示剂和以甲基橙为指示剂测得的实际样品土壤有效磷含量误差均已用绝对误差表示。根据NY/T 1121.7-2014的精密度要求，当测定值＞20 mg/kg，相对相差≤ 5%；当测定值为10～20 mg/kg，绝对差值≤ 1.0 mg/kg；当测定值＜10 mg/kg，绝对差值≤ 0.5 mg/kg，使用两种指示剂后测得的土壤有效磷结果符合误差要求。