基于SSR分子标记的桃品种鉴别及指纹图谱构建

王 淋，敖 敦，包文泉，张淑宁，陈俊兴，李凤鸣，孟繁庆，杨钰莹，白玉娥

（1.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2.内蒙古农业大学 草原与资源环境学院草地资源教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010011；3.内蒙古农业大学 林学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

桃Amygdalus persicaL.Batsch 为蔷薇科Rosaceae 李属Prunus桃亚属Amygdalus多年生落叶树种，原产自中国，是世界四大果树之一[1]。作为桃的原产地，我国具有极其丰富的桃种质资源，其桃产业、栽植面积和产量均具全球首位[2]。桃的适应性和抗逆性较强，花色美，果实风味独特，富含维生素、糖类和蛋白质，营养价值较高，可直接鲜食，还可以加工成桃干、桃果酱、桃罐头及桃果汁等产品，开发利用价值巨大。目前，我国栽培的桃种质主要以‘黄金蜜1’、‘黄金蜜13’、‘中桃6’、‘中桃9’和‘中桃13’等10 几个品种为主[3]，但由于其悠久的栽培历史和混乱的引种驯化，使我国桃种质出现了很多“同名异物”和“同物异名”；并且桃品种间树形、叶片、花器官、果实等的形态特征相似，使得传统的形态学分类法难以准确鉴定桃主栽品种，这严重地影响了跨地区间桃品种的引种效率，也给桃种质的栽培管理带来了很多不确定性[4-5]。随着分子生物学和生物信息技术的发展，分子标记技术已广泛应用于物种鉴定、系统进化、种群遗传学和分子辅助育种等研究领域。其中，SSR（Simple sequence repeat）分子标记，又称为微卫星标记，具有多态性高、重复性好、通用性强和共显性遗传标记等优点，在桃属及其近缘物种的分子研究中应用最为广泛[6-8]，但目前利用SSR 分子标记对桃主栽品种开展种质鉴定和指纹图谱构建的相关研究较少。本研究利用多态性高、稳定性强的15 个SSR 分子标记，对国内外26 个桃主栽品种进行毛细管荧光电泳检测，开展桃主栽品种的遗传多样性和亲缘关系分析，对其进行品种鉴别和SSR分子指纹图谱构建，为国内桃品种的鉴别，以及准确引种和精准栽培管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试研究材料采集于2018年6月，分别采自内蒙古农业大学职业技术学院苗圃、内蒙古林业科学研究院苗圃、中国林业科学研究院经济林研究开发中心桃基因库和内蒙古良种繁育中心桃种质资源圃，包括国内外主栽的桃品种26 个（表1），其中国内品种15 个，国外品种11 个。随机选取生长健壮、无病虫害的单株，采集嫩叶，液氮速冻带回实验室，保存于-80℃下的超低温冰箱，以备提取基因组DNA。

表1 供试桃品种及来源Table 1 Origins and cultivars of peach in the study

1.2 桃品种基因组DNA 的提取

采用高效植物基因组DNA 提取试剂盒（DP350，天根生化科技（北京）有限公司）提取供试26 个桃主栽品种的基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测所提取DNA 的含量及纯度，并将其浓度调至50 ng/μL，保存于-80℃下的超低温冰箱，以备PCR 反应扩增。

1.3 SSR 引物的筛选及PCR 反应

参考近期发表的相关文献，初步选取开发自桃及其近缘种的48 对SSR 引物供筛选，最终筛选出多态性高、稳定性强且重复性好的15 对SSR 引物，详细信息见表2。

表2 本研究所用的SSR 引物信息Table 2 Information of SSR primers used in the study

SSR 引物的PCR 扩增反应体系为25 μL，内含1 μL 目标物DNA 模板（20 ng/μL），1 μL 带荧光标记（NET、FAM、VIC 或PET）的SSR 正向引物，1 μL SSR 反向引物，12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，9.5 μL 无菌去离子水（ddH2O）。PCR 扩增反应条件如下：95℃的预变性5 min；94℃的变性30 s，54～55℃退火35 s，72℃延伸45 s，设置30 次循环，72℃终延伸5 min 后置于4℃保存。PCR 反应产物经DNA 纯化试剂盒纯化后用ABI 3500XL（Applied Biosystems，USA）遗传分析仪检测其条带峰度，利用Gene-Marker 软件读取每个SSR 位点的片段大小。

1.4 数据分析

利用GenAlEx 6.501 软件[12]分析各SSR 位点的等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、期望杂合度（He）和观察杂合度（Ho）；基于Arlequin v 3.1 软件[13]计算各SSR 位点的多态性信息指数（PIC）。用Excel 软件构建26 个桃主栽品种的SSR 分子指纹图谱。桃主栽品种的聚类分析是根据各品种间的Nei’s 遗传相似系数，由NTSYS PC version 2.10e 软件的UPGMA 法完成[12-14]。

2 结果与分析

2.1 桃主栽品种的遗传多样性

根据48 对SSR 引物在桃主栽品种的毛细管荧光电泳检测中的初步结果，筛选出多态性高、重复性强、无杂带的15 对SSR 引物，用于后续26 个桃主栽品种的遗传多样性分析和指纹图谱的构建（表3）。

表3 26 个桃主栽品种在15 个SSR 位点的遗传多样性Table 3 Genetic diversity of 15 SSR markers in 26 cultivars of peach

由表3可知，供试桃主栽品种在所筛选的15个SSR 位点上的多态性较高，15 对SSR 引物在26 个桃主栽品种中共检测到259 个等位基因（Na）和213.41 个有效等位基因（Ne），每个SSR 位点的平均Na和Ne分别为17.27 个和14.23 个；其中，位点BPPCT-025 上检测到的Na和Ne最多，分别为23 个和20.94 个，而位点pchgms-54 和UDP97-402 上的Na（12 和12 个）和Ne（10.31 和10.04 个）最少；15 个SSR 位点的期望杂合度（He）介于0.24～0.63之间，观察杂合度（Ho）介于0.29～0.79之间，其平均值分别为0.43 和0.54，表明目前桃主栽品种的遗传多样性水平适中。15 个SSR 位点的多态性信息指数（PIC）在0.75～0.91 间，其值均大于0.50，表明所选SSR 引物多态性较高，适用于供试桃主栽品种的物种鉴定、种群遗传学等相关分析。

2.2 桃主栽品种的SSR 指纹图谱

根据供试桃主栽品种在15 个SSR 位点上的毛细管荧光电泳检测条带大小，构建了26 个桃主栽品种的SSR 指纹图谱（图1）。由图1可知，单独的一个SSR 引物无法将供试26 个桃主栽品种鉴别开，只能将26 个桃主栽品种区分为4～11 组。其中，引物pchgms25 的鉴别能力最强，能鉴别‘天仙红’、‘庆丰’、‘沙红桃’、‘砂子早生’、‘松森’、‘NJN9’、‘春蕾’、‘早春红’、‘中油9’和‘加纳岩’等10 个桃品种，可将供试26个桃品种分为11 组；而引物UDP98-408 的鉴别能力最低，将供试26个桃品种分为4组，仅能鉴别‘仓方早生’、‘白风’和‘黄金蜜13’三个桃品种；其余引物的鉴别能力适中，如引物BPPCT-017 和UDP96-003 分别能鉴定‘NJN83’、‘NJN9’、‘春蕾’、‘天仙红’、‘天仙红’和‘中油13’等6 个桃品种；引物BPPCT-001 能鉴别‘京玉’、‘松森’、‘加纳岩’、‘早春红’和‘北冰洋之蓝’5个桃品种。

图1 基于15 对SSR 引物的26 个桃主栽品种的指纹图谱Fig.1 Fingerprinting key of 26 peach cultivars using the 15 SSR markers

26 个桃主栽品种在15 个SSR 位点上的目标片段大小在95～416 bp 之间，其中引物pchgms25 单独鉴别桃品种的能力最强，若将引物pchgms25 分别与引物PceGA25、UDP96-003、UD98-412-50、UDP98-409、UDP98-406、UDP97-402、Pchgms4-54、BPPCT-001 相结合则能够将供试26 个桃主栽品种全部鉴别开。

2.3 基于SSR 标记的26 个桃主栽品种的聚类分析

根据26 个桃主栽品种在15 个SSR 位点的等位基因频率，计算桃品种间的Nei’s 遗传相似系数，并利用NYSYSPC2.1 软件的UPGMA 法对供试桃主栽品种进行遗传相似系数的聚类分析（图2）。由聚类分析结果可知，26 个桃主栽品种间的遗传相似系数在0.64～0.94 之间，平均遗传相似度为0.79；其中，品种‘松森’与‘白风’的遗传相似度最高，亲缘关系最近，遗传相似度为0.94；而品种‘早春红’与‘加纳岩’的亲缘关系最远，遗传相似度为0.64。

图2 基于SSR 标记的26 个桃主栽品种UPGMA 聚类分析Fig.2 Dendrogram of 26 peach cultivars based on UPGMA of SSR polymorphisms

根据UPGMA 法的聚类分析结果可知，在遗传相似系数为0.70 时，可将26 个桃主栽品种分为3 组，其聚类结果与品种来源基本一致。第一组包括12 个桃品种，其中 ‘大久保’、‘京玉’、‘NJN9’和‘庆丰’等品种与由‘NJN83’选育的‘黄金蜜1’、‘中油9’、‘北冰洋之蓝’和‘春蜜’优先聚在一起；此外，由‘黄金蜜13’选育出的“中桃6”和‘中油13’再聚在一起，组成第一组群。第二组包括13 个桃品种，由‘朝晖’选育的优良品种‘加纳岩’、‘砂子早生’、‘霞晖’、‘松森’、‘白风’、‘雨花露’以及‘天仙美’、‘早美’、‘春蕾’、‘布目早生’、‘沙红桃’和‘仓方早生’等品种组成；第三组仅包括‘早春红’。

3 讨 论

本研究利用毛细管荧光电泳法检测SSR 位点片段大小，与常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法相比，具有操作简单、结果准确、通量高等优点，是目前研究物种分类、品种鉴定和系统发育等领域中最常用的方法[14]。SSR 分子标记具有多态性高、稳定性高、通用性强等优点，可在近缘物种间直接筛选应用，本研究利用开发自桃及其近缘物种的SSR 分子标记，结果表明所选SSR 分子标记具有较高的多态性和通用性，这与Sanchez-Perez 等[15]和包文泉等[10]的研究结果一致，桃、樱桃、扁桃和杏等蔷薇科树种间的SSR 分子标记具有极高的通用性和稳定性，后期直接选择桃、杏、梅、扁桃的基因组序列，开发SSR 分子标记，用于桃属、杏属以及其他近缘物种的相关研究，可节省从头开发SSR 分子标记的经费和人力。

等位基因数量是衡量SSR 分子标记多态性高低和应用范围的重要指标，其高低是SSR 分子标记开发和筛选的优选条件[16-17]。本研究所用的15个SSR 位点平均等位基因（Na）和平均效等位基因（Ne）分别为17.27 个和14.23 个，说明桃主栽品种的遗传多样性及水平适中，这一结果高于凌士鹏等[18]利用12 对SSR 引物对53 份桃品种检测到的7.92 个等位基因，也高于魏姗姗等[19]利用18 对SSR 引物检测95 个桃品种的结果（平均每位点的Na为5.17），这可能与本研究所用材料有关，因为本研究所用桃品种中既有国内的品种，也有国外的品种，并且国内桃品种来自不同地区的不同品系，因此供试桃品种本身多样性可能较高；还可能与本研究前期对SSR 引物进行了严格的多态性筛选有关，进而造成本研究中桃品种的遗传多样性较高[10]。

通常分子标记的多态性信息指数（PIC）若大于0.50 则说明该标记具有较高的多态性，可直接用于后期相关分析[12]。本研究所用15 个SSR标记的多态性信息含量（PIC）值均大于0.75（0.75～0.91），表明所筛选SSR 标记均完全适用于桃种质资源的遗传多样性分析。但供试15 个SSR 标记鉴别能力存在较大的差异，并且绝大数标记的鉴别能力有限，其中仅有pchgms25 标记能够鉴别出10 个不同桃品种，其余14 个供试SSR 标记的鉴别能力均较低，若想将供试26 个桃主栽品种一一鉴别，至少将利用pchgms25、PceGA25、

UDP96-003、UD98-412-50、UDP98-409、UDP98-406、UDP97-402、Pchgms4-54、BPPCT-001 等9个SSR 标记相结合，说明目前的桃主栽品种间遗传距离较近，桃主栽品种的遗传背景较狭窄。这与本研究中聚类分析得出的26 个桃主栽品种间的遗传相似度较高（0.64～0.94）相一致，也与李建辉等[4]和罗慧等[5]的研究结果一致。这可能与桃种质资源悠久的栽培历史中频繁地异地引种和驯化有关[19-20]，也可能与供试品种的选育技术和育种过程有关[21-22]。因此，后期在桃种质的遗传改良、种质创新及选育良种中应注意选择亲缘关系较远的资源[23-25]，以期提高桃种质的遗传多样性和育种效率，避免后期可能出现的桃品种遗传退化[26]。

通过聚类分析可将26 个桃主栽品种分为3 组，其中，同品系品种优先聚为一组，其分组结果与品种来源基本一致，这与罗慧等[5]及陈传爱等[7]研究结果一致。说明不同系列品种间基因交流少，此结果可为后期桃种质的遗传改良、新品种选育、种质创新等研究工作中的育种亲本的选择提供重要依据，还可为建立桃核心种质库和资源圃等提供理论依据。

本研究利用15 个SSR 分子标记对26 个桃主栽品种进行了品种鉴别和指纹图谱构建，为桃种质资源的栽培管理提供了较为精确、高效的鉴别技术支撑，但除了pchgms25 标记外，其余标记的鉴别能力有限，要将众多个桃品种鉴别所需要的SSR 标记数量较多，工作量较大，所需时间较长。因此，后期应该加强利用桃基因组序列数据的进一步挖掘，开展分子生物学研究，开发更高效的分子标记，如从DNA 序列水平上开发单核苷酸多态性（SNP）标记，为桃品种鉴定提供更高效的技术和理论支撑。

4 结 论

本研究通过15 个SSR 分子标记对26 个桃主栽品种进行了品种鉴别和指纹图谱构建研究，研究结果表明目前桃主栽品种的遗传多样性水平适中，但桃主栽品种的遗传背景较狭窄，遗传相似度较高，不同品系间基因交流较少。本研究结果可为桃种质资源的创新、核心种质资源库的建立以及桃种质资源的保护与利用提供理论与技术支撑。