水通道蛋白3在大鼠结肠黏膜中的表达

刘耀文　曾玉娟　瞿丹　粟慧敏　陈行　徐赛群

摘要：目的：探讨水通道蛋白3（aquaporins，AQP3） 在大鼠结肠黏膜中的表达。方法：挑选10只Sprague-Dawley（SD） 大鼠，体重（200±50） g，雌雄各半，并将动物麻醉处死后取近端结肠和远端结肠组织，用冰PBS溶液冲洗干净后分成三部分，一部分置于冻存管中-70℃保存用于提取RNA，一部分置于冻存管中-70℃保存用于提取蛋白，剩余的组织放入4 %多聚甲醛中进行固定，石蜡包埋后制备组织切片（厚度4 ?m） 。结果：RT-PCR结果表明在近端结肠和远端结肠有丰富的AQP3 mRNA表达，且远端结肠AQP3 mRNA表达明显高于近端结肠AQP3 mRNA表达;Westernblot来检测大鼠结肠AQP3蛋白的表达，AQP3的光密度值除以β-Actin的光密度值用以做标准化。结果显示近端结肠有两条AQP3条带：一条位于27 kDa，代表未糖基化的AQP3;另一条位于30-40 kDa，代表糖基化的AQP3。而远端结肠仅有一条位于30-40 kDa的糖基化的AQP3条带。定量结果显示近端结肠和远端结肠有丰富的AQP3表达;免疫组化来检测大鼠消化系统AQP3的定位。在大鼠结肠中AQP3主要表达单层柱状上皮;且在近端结肠和远端结肠，AQP3常表达于表面吸收上皮细胞的基底侧膜上和肠隐窝的颈部。结论：AQP3表达于单层柱状上皮细胞（近端结肠和远端结肠） 的基底侧膜上。

关键词：AQP3;AQP3 mRNA;结肠黏膜

水通道蛋白（aquaporins，AQPs） 是一类存在于细胞膜的小分子蛋白，在动植物体内广泛表达。AQP3广泛表达于消化系统、呼吸系统、泌尿系统和皮肤系统的上皮组织中。AQP3阴性的小鼠中角质层水合作用减少，皮肤的弹性降低。消化系统中也可能有类似的作用[1]。另一个可能作用是指向固有层的跨上皮液体流动，作为小肠中水吸收的机制。AQP3基因敲除小鼠存在肠上皮细胞增殖受损和单核细胞功能存在缺陷，提示AQP3不仅在感染和炎症状态下对免疫功能有着重要的调节作用，而且对肠上皮细胞增殖起重要的作用[2]。因此，本文采取real-time PCR、westernblot和免疫组化实验来系统性的验证AQP3在正常结肠中的表达量。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 动物及饲养环境

10只Sprague-Dawley（SD） 大鼠，体重（200±50） g，雌雄各半。饲养于长沙医学院动物实验中心。实验室相对湿度保持在40 %～60 %，实验大鼠统一置于22～25℃的温度下进行饲养，光照充足，安静卫生，通风良好。10只大鼠单笼饲养，饲料充足，实验大鼠可自由摄取清洁饮水，实验操作严格遵守《湖南省实验动物管理条例》。

1.2 主要藥品与试剂

AQP3抗体（兔抗大鼠） 、PCR试剂盒、二步法免疫组化检测试剂。智能水分测定仪TMP-300 S，石蜡切片机LEICA CM1850，光学显微镜CX31，LightCycler96荧光定量PCR仪（显微照相机BX-50） ，电子分析天平METTLER-AB304-S。

1.3 方法

1.3.1 样本采集

动物麻醉处死后取近端结肠和远端结肠组织，用冰PBS溶液冲洗干净后分成三部分，一部分置于冻存管中-70℃保存用于提取RNA，一部分置于冻存管中-70℃保存用于提取蛋白，剩余的组织放入4 %多聚甲醛中进行固定，石蜡包埋后制备组织切片（厚度4 ?m） 。

1.3.2 RT-PCR检测大鼠结肠组织AQP3的表达

首先将组织石蜡切片脱腊，3 %H2 O2室温孵30 min，然后PBS冲洗，滴加10 %正常山羊血清封闭液37℃孵育30 min;加入一抗兔抗大鼠抗体（1：100稀释） 孵育，PBS冲洗，滴加二抗山羊抗兔IgG孵育，PBS冲洗，滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP） 孵育，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照：一抗用PBS代替。阳性细胞胞浆呈棕褐色。结果判定：染色指数=染色强度积分×染色面积比。染色强度积分，按显色强弱记录为：阴性0分，弱阳性1分，阳性2分，强阳性3分。染色面积比为腺体中染色细胞数占总体细胞数的百分比。

1.3.3 Westernblot检测结肠AQP3蛋白的表达

取大鼠结肠组织分别放于玻璃匀浆器中，按照1：10加入裂解液，0℃下进行匀浆，4℃裂解30 min，4℃12000 r/min离心30 min，取上清液备用。BCA法测定蛋白含量后上样（蛋白浓度每孔50 ug） ，每孔20 uL，加入缓冲液，100℃下水浴5 min使蛋白充分变性。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） ，将蛋白质电转移到聚偏氟乙烯（PVDF） 膜上。5 %脱脂牛奶封闭后，加入一抗（AQP3，1∶300） ，4℃过夜，TBST洗膜3次，10分钟/次，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，10分钟/次，ECL试剂与膜作用后，Bio-Rad公司图像摄取系统曝光，采集图像并进行分析。计算AQP3与tubulin产物A积分的比值，实验重复3次。

1.3.4 结肠组织AQP3 mRNA表达

将结肠标本放入液氮预冷的研钵中研磨，按照常规方法提取总RNA，然后用RT-PCR方法测定各组大鼠结肠组织AQP3基因的mRNA，进行相对表达量分析。

RT-PCR引物序列：AQP3上游引物：5'-TGGTGGCTTCCTCACCATCAA-3'，下游引物：5'-AGAGCCCAAAAACAATCCCAGC-3'，扩增片段长度为209 bp;β-actina上游引物：5'-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3'，下游引物：5'-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3'，扩增片段长度为592 bp。

1.4 统计学处理

应用SPSS 23.0软件对临床资料进行统计分析，计数资料用（%） 表示，行χ²检验;计量资料用（x±s） 表示，行t检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠结肠AQP3 mRNA的表达

RT-PCR结果表明在近端结肠和远端结肠有丰富的AQP3 mRNA表达，且远端结肠AQP3 mRNA表达明显高于近端结肠AQP3 mRNA表达。

2.2 大鼠结肠AQP3蛋白的表达

采用Westernblot来检测大鼠结肠AQP3蛋白的表达，AQP3的光密度值除以β-Actin的光密度值用以做标准化。结果显示近端结肠有两条AQP3条带：一条位于27 kDa，代表未糖基化的AQP3;另一条位于30-40 kDa，代表糖基化的AQP3。而远端结肠仅有一条位于30-40 kDa的糖基化的AQP3条带。定量结果显示近端结肠和远端结肠有丰富的AQP3表达。

2.3 大鼠结肠AQP3免疫组化染色

采用免疫组化来检测大鼠消化系统AQP3的定位。在大鼠结肠中AQP3主要表达单层柱状上皮;且在近端结肠和远端结肠，AQP3常表达于表面吸收上皮细胞的基底侧膜上和肠隐窝的颈部。具体见下图。

3 讨论

Agre研究发现，水通道蛋白（Aquaporin，AQP） 广泛分布在哺乳动物和植物细胞膜上，是一组与水通道有关的细胞膜转运蛋白，是影响水的跨膜转运和细胞内外环境平衡调节的主要蛋白，并因此获2003年诺贝尔化学奖。迄今为止已从哺乳动物中鉴定并克隆了11种水通道蛋白（AQP0-AQP10） [3]。水通道蛋白是一类相对分子量为20～30 kD左右膜蛋白的大家族，每一种水通道蛋白均含6个跨膜区及细胞内氨基和羧基末端的蛋白质。Verkman成功建立了AQP1、3、4、5基因敲除鼠模型，系统研究AQP对肾脏浓缩功能的影响，对肺水肿和脑水肿等的影响。国内学者已做了类似的研究，但至今未见AQP对腹泻病影响的研究报道，特别是有关AQP3对腹泻病的相关研究，国内外更未见報道。

AQP3从肾脏中分离获得，定位于肾集合管主细胞的基底膜上，和顶端膜上的AQP2共同参与对水的重吸收[4]。AQP3的表达通过高渗和高张而上调，其是水甘油通道蛋白的一员，允许水、尿素和甘油的通过。我们检测了AQP3在大鼠结肠的免疫组化定位。AQP3表达于单层上皮细胞。AQP3可能的作用就是为上皮细胞补充水分，为这些上皮细胞面临恶劣的环境等。

参考文献

[1]张静霞，黎兆军.AQP3在皮肤病发病机制中的作用研究进展[J].医学综述，2013，19（17）：3.

[2]张迪，苏维恒，赵元，等.水通道蛋白AQP3缺失对小鼠坐骨神经损伤修复的影响[J].中国兽医杂志，2017，53（10）：4.

[3]张玉婷，张琪，郭抗抗，等.水通道蛋白在动物疾病发生过程中的作用研究进展[J].动物医学进展，2021，42（3）：4.

[4]张冬梅，许钟镐，辛丽，等.AQP1、AQP2和AQP3在肾小球疾病肾组织中的表达及其意义[J].中国免疫学杂志，2009，25（1）：3.